福建省耐多藥結核分枝桿菌對吡嗪酰胺的耐藥水平與基因型特征分析

林淑芳 魏淑貞 趙永 林建 林勇明

吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)是一線抗結核藥物化療方案的柱石，在酸性環境下對半休眠結核分枝桿菌(MTB)和持留MTB具有獨特的滅菌作用，與異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RFP)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)聯合用于敏感結核病化療可將療程縮短為6個月。PZA除了具有與眾不同的藥理作用之外，還與貝達喹啉和PA-824 等2個新藥具有協同抗結核作用[1-3]，因而PZA也作為非常重要的藥物用于治療耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)。盡管PZA對治療結核病至關重要，但是因為PZA對體外藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)條件要求比較高，限制了其耐藥性檢測的普遍開展，而且沒有像INH、RFP和EMB一樣納入到常規耐藥監測當中，所以全球對PZA的耐藥性研究相對比較少[4]。因此，了解MDR-TB對PZA的耐藥現狀對于指導臨床合理用藥非常有意義。

結核病分子流行病學研究顯示，全球結核病流行主要由北京家族、T家族、H家族、CAS家族、LAM家族等菌株群引起，目前多個國家和地區報道北京基因型是主要優勢基因型[5-6]。北京基因型導致多個國家MDR-TB的暴發。間隔區寡核苷酸分型技術(Spoligotyping)是鑒定北京基因型的金標準，具有可靠、高效和數字化等特點而被廣大實驗室廣泛應用[7-8]。國內外對MDR-MTB北京基因型菌株與對PZA耐藥性的關系研究不多，因此，筆者應用Spoligotyping技術鑒定福建省MDR-MTB的基因型，了解基因型分布情況和北京基因型流行情況，同時分析對PZA的耐藥水平及與不同基因型菌株間的關系。

材料和方法

一、菌株來源

收集2007—2008年福建省耐藥監測點40株MDR-MTB臨床分離株，以及2010—2011年第五輪全球基金結核病項目福建省耐藥監測點79株MDR-MTB臨床分離株，共計119株。MTB標準株H37Rv由國家結核病參比實驗室提供。

二、藥敏試驗

采用Guidelinesforsurveillanceofdrugresis-tanceintuberculosis[9]推薦的比例法對INH、鏈霉素(Sm)、RFP、EMB等4種抗結核藥物進行藥敏試驗。采用WHO[10]推薦的BACTEC MGIT 960系統法(簡稱“MGIT 960”)檢測MDR-MTB 對PZA的耐藥性，濃度為100 μg/ml。

三、細菌DNA制備

從羅氏(L-J)培養基中生長良好的MTB取一菌環，溶于200 μl的TE緩沖液(pH 8.3)中，在旋渦振蕩器中振蕩均勻后，放在95 ℃水浴鍋中15 min后，以10 000×g離心5 min，取上清。

四、間隔區寡核苷酸基因分型

(1)直接重復(DR)間隔區特異性核苷酸探針序列共43條，見文獻[11]。DR間隔區擴增引物序列：DRa：5′-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3′； DRb：5′-CCGAGAGGGGACGGAAC-3′。其中，DRa的5′端用生物素標記，用于雜交后發光檢測。(2)43條探針按順序用Miniblotter標記在Biodync C膜上(美國Pall 公司)。(3)DR間隔區PCR擴增體系為50 μl，PCR預混液25 μl，DRa和DRb各2 μl，DNA模板5 μl，去離子水16 μl。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 50 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃延伸8 min。同時擴增H37Rv和BCG作為陽性對照。(4)用Miniblotter與探針垂直方向加入DR間隔區PCR擴增產物、H37Rv和BCG，空白對照。雜交爐內50 ℃雜交1 h。(5)雜交膜處理后，加入鏈霉親和素-過氧化物酶偶聯物(CDP-Star，購自美國GE公司)孵育，42 ℃孵育30 min，在暗室內曝光、顯影。(6)雜交結果陽性用“1”，陰性用“0”表示，錄入到Excel表以二進制和八進制格式描述每株菌的分型結果。Spoligotyping結果提交至SpolDB 4.0(http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVITDemo)[12]和國際數據庫MIRU-VNTR plus(http://www.miru-vntrplus.org)[13]。

五、統計學處理

應用BioNumerics 5.0進行分析，采用UPGMA系數進行聚類分析。應用SPSS 13.0軟件進行統計分析，菌株基因型與其耐藥性之間的差異性分析采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、PZA耐藥情況

119株MDR-MTB菌株應用MGIT 960進行PZA藥敏試驗，結果顯示44株對PZA耐藥，耐藥率為36.97%(44/119)。耐PZA菌株對Sm的耐藥率為70.45%(31/44)，高于對PZA敏感菌株對Sm的耐藥率[50.67%(38/75)]，差異有統計學意義(χ2=4.45，P=0.035)；耐PZA菌株對EMB的耐藥率為81.82%(36/44)，高于對PZA敏感菌株對EMB的耐藥率[52.00%(39/75)]，差異有統計學意義(χ2=1.58，P=0.001)。

二、MDR-MTB菌株的基因型構成

119株MDR-MTB菌株經Spoligotyping進行基因分型，結果顯示分為2個基因群，即北京基因型和非北京基因型；共鑒定出9個基因型(即北京基因型和8個非北京基因型)；另有8株菌株的基因型在SpolDB 4.0數據庫中檢索不到相同序列，判為新發現的基因型，經聚類分析，均為非北京基因型的獨特類型。其中，北京基因型菌株80株，占67.23%；非北京基因型39株(32.77%)，呈現出16個基因型(含8個新發現的基因型)，具體包括H家族(含4株H和10株H3)14株(11.76%，14/119)、T家族(含8株T1、1株T2、4株T3和1株T5)14株(11.76%，14/119)、新發現的基因型8株(6.72%，8/119)、U基因型2株(1.68%，2/119)、Manu2基因型1株(0.84%，1/119)。非北京基因型以H3(25.64%，10/39)和T1(20.51%，8/39)比較常見。聚類結果顯示，19株為獨特類型，其余100株分為7簇，成簇率為84.03%(100/119)，每簇含2株及以上，其中最大的一簇包含75株，菌株全部為ST1，即僅與SP35～SP43之間9個間隔區有陽性雜交信號，被稱為典型北京基因型。

三、北京基因型與耐藥的關系

80株北京基因型菌株有31株對PZA耐藥(38.75%)，49株對PZA敏感(61.25%)；39株非北京基因型菌株有13株對PZA耐藥(33.33%)，26株對PZA敏感(66.67%)。北京基因型菌株對PZA的耐藥率與非北京基因型菌株對PZA的耐藥率比較，差異無統計學意義；北京基因型與非北京基因型菌株對Sm、EMB耐藥率比較，差異均無統計學意義(表1)。

討 論

MDR-TB化療方案的一線和二線藥物中PZA發揮獨特的作用，全面了解MDR-MTB菌株對PZA的耐藥水平，對MDR-TB患者進行合理治療具有非常重要的意義。由于PZA僅在酸性(pH 5.0左右)環境下才能發揮抗MTB的作用，而低pH值又抑制MTB的生長，實驗過程中如pH值輕微變動或接種量改變將引起最低抑菌濃度(MIC)的大幅度變化從而使得傳統培養方法基礎上的PZA藥敏試驗結果可靠性比較差。為了更好指導臨床用藥，WHO推薦[10]應用由美國BD公司研制生產的MGIT 960對PZA進行液體藥敏試驗檢測。該方法在美國、日本和歐洲等發達地區作為PZA藥敏試驗的標準方法。筆者應用此法對福建省MDR-MTB菌株進行PZA耐藥性檢測，對PZA的耐藥率為36.97%，與上海的38.5%[14]和美國的38%[15]不相上下，低于北京市的57.7%[16]和重慶市的62.4%[17]。此結果提示，福建省MDR-TB患者應用PZA進行化療時，應考慮患者可能存在對PZA耐藥的問題。本次研究結果顯示，對Sm和EMB耐藥的MDR-MTB菌株對PZA的耐藥率均明顯高于對Sm、EMB敏感的菌株，表明MDR-MTB菌株對PZA耐藥與對Sm、EMB耐藥具有一定相關性。重慶市報道了MTB對PZA耐藥與對Sm耐藥具有一定相關性，而與對EMB耐藥無關[17]。也有文獻報道MTB對 PZA耐藥與對RFP耐藥和氧氟沙星(Oflx)耐藥具有相關性，也就是對RFP、Oflx耐藥的菌株對PZA的耐藥率也較高[18]。這可能是患者未經藥敏試驗就聯合多種藥物治療所導致的[19]。先前福建省對涂陽肺結核患者對PZA耐藥的研究顯示，MDR-TB患者對PZA的耐藥率明顯高于非MDR-TB患者[20]。可見，臨床上為了確保MDR-TB患者使用合理的化療方案，先行對PZA進行耐藥性檢測顯得尤為重要。

表1 福建省耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株耐藥情況與基因型分布的關系

北京基因型MTB分布廣泛而備受全球關注，主要流行于東亞地區、中國、韓國和日本[21-22]。筆者采用Spoligotyping對MDR-MTB菌株進行分型，結果顯示北京基因型占67.23%，高于廣西壯族自治區的55.3%[23]，低于浙江省的70%[24]和河北省的90.5%[25]。進一步體現了北京基因型分布具有地域性，說明了北京基因型是福建省的主要流行基因型。該基因型菌株流行速度快，傳播范圍廣，因此，今后工作中應加強對北京基因型菌株的監測，發現其傳播規律，并對其生物學特征進行深入研究。

本次研究結果顯示，MDR-MTB菌株非北京基因型占32.77%，呈現為高度的基因多態性，共16種基因型，以H家族和T家族多見。其中，H3和T1比較常見。據報道，H家族和T家族主要流行于非洲、歐洲和中、南美洲地區[12]。本次研究中H家族和T家族常見可能與福建省位于東南沿海，與全球各地經濟貿易往來比較頻繁及日益發達的旅游業引起人口流動性較大有關，再者也可能與福建省的氣候常年炎熱和潮濕有關。此結果提示，福建省結核病防治應該加強對流動性人口結核病的管理和監測。盡管H家族和T家族也流行于全球其他地區，但是這兩個家族具有很高的遺傳異質性，不像北京基因型家族基因高度保守，而且Spoligotyping指紋圖譜特征不明確。進一步表明了今后應該探索其適宜的遺傳標志物來加強對這2個家族的監測，為全省結核病防治策略制定提供參考依據。

盡管文獻報道北京基因型多次引起MDR-TB的暴發，但是關于北京基因型與耐藥性之間的關系，我國各地研究結果不盡相同。有報道北京基因型與耐藥性無關[23-24]，也有報道北京基因型與RFP耐藥、MDR和Oflx耐藥有關[26-27]。本研究顯示，北京基因型與非北京基因型對PZA耐藥率的差異無統計學意義。其中，北京基因型與PZA耐藥性無關未見相關文獻報道。目前報道北京基因型與耐藥性的關系研究基本上就只是常規納入耐藥監測的6種藥物RFP、INH、Sm、EMB、Oflx和卡那霉素進行分析[26-27]。因此，北京基因型菌株與耐藥表型之間的關系及其生物學特征還有待進一步研究。

本研究也存在一定的缺陷，即采用菌株來源于2007—2008年和2010—2011年福建省耐藥監測點，距今時限較久。但是當時的監測點多，覆蓋面廣，因此，收集到的菌株具有較好的代表性。

志謝中國疾病預防控制中心傳染病控制所萬康林研究員、劉海燦博士對本研究進行了悉心指導和幫助。