分枝桿菌雙相羅氏培養(yǎng)基在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用研究

宋媛媛 劉二勇 陶波山 黃費(fèi)湘 肖亞利 藍(lán)如束 譚云洪 李輝 葉磊 成詩(shī)明 趙雁林

結(jié)核病細(xì)菌學(xué)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是培養(yǎng)法，其既是結(jié)核病最可靠的檢測(cè)方法，也是獲得陽(yáng)性培養(yǎng)物進(jìn)行菌種鑒定、藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)及分子生物學(xué)檢測(cè)研究的基礎(chǔ)。目前，公認(rèn)的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)方法有2種，即快速液體培養(yǎng)法和固體羅氏培養(yǎng)法。快速液體培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果報(bào)告的時(shí)間快，陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告時(shí)間一般為10～20 d，陰性結(jié)果報(bào)告時(shí)間為42 d，但其價(jià)格昂貴，需要特殊儀器，在基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)使用受到一定的限制。固體羅氏培養(yǎng)法是傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，也是我國(guó)普遍應(yīng)用的分枝桿菌培養(yǎng)方法，報(bào)告結(jié)果的時(shí)間較長(zhǎng)，一般陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告時(shí)間為20～30 d，陰性結(jié)果報(bào)告時(shí)間為56 d。其價(jià)格低廉，能在縣(區(qū))級(jí)基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)使用。

分枝桿菌雙相羅氏培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱“雙相培養(yǎng)基”)是一種能促進(jìn)分枝桿菌快速生長(zhǎng)的新型培養(yǎng)基，陰性結(jié)果報(bào)告時(shí)間為42 d。其結(jié)合了改良羅氏培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)，分枝桿菌可在培養(yǎng)基的固體斜面上形成典型的菌落，同時(shí)又因?yàn)楹酗@色劑，在液體培養(yǎng)基中呈現(xiàn)粉紅色或紅色顆粒狀生長(zhǎng)。為探討該培養(yǎng)基在基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用的可行性，筆者選取我國(guó)3個(gè)省的3個(gè)地市級(jí)結(jié)核病診療機(jī)構(gòu)，采用多中心試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)該培養(yǎng)基在結(jié)核病診斷中的價(jià)值。

材料和方法

1.研究對(duì)象：連續(xù)納入2014年10月至2015年10月在廣西壯族自治區(qū)北海市結(jié)核病防治院、湖南省邵陽(yáng)市結(jié)核病防治醫(yī)院、河南省南陽(yáng)市第六人民醫(yī)院就診的初診肺結(jié)核可疑癥狀者作為研究對(duì)象，共計(jì)2320例。其中，肺結(jié)核患者1176例，非肺結(jié)核患者1144例；其中，男1536例(66.21%)，女784例(33.79%)；最小年齡10歲，最大年齡104歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1,Q3)]為50(33, 63)歲；其中15例因分枝桿菌改良羅氏培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱“羅氏培養(yǎng)基”)和雙相培養(yǎng)基中的1種或2種培養(yǎng)污染或結(jié)果缺失，故在兩種培養(yǎng)基檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)不計(jì)入分析。由接受過(guò)培訓(xùn)的臨床醫(yī)生詢問(wèn)研究對(duì)象的基本信息、本次就診癥狀及病史，并結(jié)合細(xì)菌學(xué)檢查和X線胸部攝影(簡(jiǎn)稱“胸片”)結(jié)果，參考《WS 288—2008 肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》[1]診斷肺結(jié)核患者。每例患者均有胸片，并均留取3份痰標(biāo)本(即時(shí)痰、夜間痰、晨痰)進(jìn)行萋-尼染色法涂片鏡檢(簡(jiǎn)稱“涂片”)，并選取2份性狀好的痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)、雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.試劑及培養(yǎng)基：萋-尼染色液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。羅氏培養(yǎng)基購(gòu)自河南省賽諾特生物技術(shù)有限公司，由7 ml改良羅氏培養(yǎng)基組成，陰性結(jié)果觀察至第8周報(bào)告。雙相培養(yǎng)基購(gòu)自珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司，由固體和液體兩部分組成；固體部分含有7 ml國(guó)內(nèi)外通用的改良羅氏培養(yǎng)基成分，液體部分由3 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基、促生長(zhǎng)劑、抑菌劑和顯色劑組成；陰性結(jié)果觀察至第6周報(bào)告。

3.涂片鏡檢：萋-尼染色法涂片鏡檢遵照《痰涂片顯微鏡檢查標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[2]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序執(zhí)行。

4.痰標(biāo)本前處理方法及培養(yǎng)：采用中和離心法對(duì)同一份痰標(biāo)本進(jìn)行去污染處理，分別接種0.1～0.15 ml在羅氏培養(yǎng)基和雙相培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，遵照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[3]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序執(zhí)行。

5.質(zhì)量保證：(1)制定項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作程序手冊(cè)及質(zhì)量保證手冊(cè)。(2)研究人員統(tǒng)一經(jīng)過(guò)培訓(xùn)合格。(3)國(guó)家級(jí)和省級(jí)疾控中心(結(jié)核病防治所)對(duì)項(xiàng)目點(diǎn)每3個(gè)月進(jìn)行1次督導(dǎo)。(4)每月進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，包括標(biāo)本量、陽(yáng)性率、涂陽(yáng)培陽(yáng)率、涂陽(yáng)培陰率、污染率。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用SPSS 24.0軟件，采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)比較兩種培養(yǎng)基的陽(yáng)性檢出率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；分別以羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果、臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)雙相培養(yǎng)基的檢測(cè)效能進(jìn)行評(píng)價(jià)；采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)羅氏培養(yǎng)基與雙相培養(yǎng)基檢出時(shí)間的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.陽(yáng)性檢出率：在初診肺結(jié)核可疑癥狀者中，涂片陽(yáng)性率為15.30%(355/2320)； 羅氏培養(yǎng)基和雙相培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)方法陽(yáng)性檢出率分別為19.65%(453/2305)和22.00%(507/2305)，后者較前者高2.34%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.091，P=0.000)。在臨床診斷的肺結(jié)核患者中，涂片陽(yáng)性率為30.19%(355/1176)；涂片加羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)陽(yáng)性率為43.11%(507/1176)；涂片加雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)陽(yáng)性率為46.34%(545/1176)。

2.以羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)雙相培養(yǎng)基檢測(cè)效能的評(píng)價(jià)：雙相培養(yǎng)基的敏感度為91.39%(414/453)，特異度為94.98%(1759/1852)，一致率為94.27%(2173/2305)(表1)。假陰性率為8.61%(39/453)，假陽(yáng)性率為5.02%(93/1852)。在雙相培養(yǎng)基檢測(cè)出現(xiàn)假陰性的39例患者中，有24例涂片結(jié)果為陰性，8例涂片結(jié)果為1～8條/300個(gè)視野或+；有15例羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果為實(shí)際菌落數(shù)，13例羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果為+；在雙相培養(yǎng)基檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性的93例患者中，雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果均為實(shí)際菌落數(shù)。

3.以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)羅氏培養(yǎng)基和雙相培養(yǎng)基的診斷價(jià)值：羅氏培養(yǎng)基診斷肺結(jié)核患者時(shí)ROC曲線下面積為0.694(95%CI：0.672～0.715)，與完全無(wú)價(jià)值的診斷試驗(yàn)曲線下面積0.5相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=17.636,P=0.000),診斷價(jià)值較低。雙相培養(yǎng)基診斷肺結(jié)核患者時(shí)ROC曲線下面積為0.707(95%CI：0.685～0.728)，與完全無(wú)價(jià)值的診斷試驗(yàn)曲線下面積0.5相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=18.818,P=0.000),診斷價(jià)值中等。對(duì)兩種培養(yǎng)基的曲線下面積進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.836，P=0.403)(圖1)。

圖1 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，羅氏培養(yǎng)基和雙相培養(yǎng)基診斷肺結(jié)核患者的ROC曲線

4.羅氏培養(yǎng)基與雙相培養(yǎng)基報(bào)陽(yáng)時(shí)間分析：羅氏培養(yǎng)基報(bào)陽(yáng)時(shí)間中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1,Q3)]為28(21,34) d，雙相培養(yǎng)基報(bào)陽(yáng)時(shí)間M(Q1,Q3)為18(14,24) d，雙相培養(yǎng)基比羅氏培養(yǎng)基報(bào)陽(yáng)時(shí)間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=15.114，P=0.000)。不同涂片結(jié)果使用雙相培養(yǎng)基較羅氏培養(yǎng)基報(bào)陽(yáng)時(shí)間均明顯縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 以羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)雙相培養(yǎng)基檢測(cè)效能的評(píng)價(jià)

注敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%

表2 不同涂片結(jié)果使用羅氏培養(yǎng)基和雙相培養(yǎng)基報(bào)陽(yáng)時(shí)間比較

討 論

在結(jié)核病防治工作中快速診斷結(jié)核病至關(guān)重要，診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)是培養(yǎng)法。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道雙相培養(yǎng)基、加入不同營(yíng)養(yǎng)物的固體培養(yǎng)基、各類液體培養(yǎng)基與羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果相比，陽(yáng)性檢出率提高分別在0.8%～7.2%[4-6]、1.6%～7.1%[7-9]、0.4%～7.5%[10-14]之間。本研究雙相培養(yǎng)基較羅氏培養(yǎng)基陽(yáng)性檢出率提高2.34%，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。雙相培養(yǎng)基液體部分可達(dá)到快速培養(yǎng)的目的，固體部分可提供分枝桿菌典型菌落，體現(xiàn)了雙相培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)[15]；一般的液體培養(yǎng)基陽(yáng)性菌落呈白色顆粒狀，難以鑒別菌落特性[5]，本研究的雙相培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入了顯色劑，實(shí)驗(yàn)員可通過(guò)肉眼觀察雙相培養(yǎng)基變色情況判斷是否有分枝桿菌生長(zhǎng)。

本研究顯示雙相培養(yǎng)基的敏感度為91.39%，特異度為94.98%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16-20]，雙相培養(yǎng)基、加入不同營(yíng)養(yǎng)物的固體培養(yǎng)基、各類液體培養(yǎng)基的敏感度在67.3%～98.3%、特異度在84.4%～100%，本研究結(jié)果在文獻(xiàn)報(bào)道范圍內(nèi)，且敏感度、特異度較高。雙相培養(yǎng)基與羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果的一致率為94.27%，假陰性率為8.61%，假陽(yáng)性率為5.02%。在雙相培養(yǎng)基檢測(cè)出現(xiàn)假陰性的39例患者中，有24例涂片結(jié)果為陰性，8例涂片結(jié)果為1～8條/300個(gè)視野或+；有15例羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果為實(shí)際菌落數(shù)，13例羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果為+，由此得出盡管羅氏培養(yǎng)基檢出陽(yáng)性，但陽(yáng)性級(jí)別較低，而且多數(shù)是僅為其中1份痰標(biāo)本檢出陽(yáng)性，且涂片結(jié)果大多為陰性，因此雙相培養(yǎng)基沒(méi)能檢出也存在較大可能。出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因主要是雙相培養(yǎng)基診斷價(jià)值較高，檢出了羅氏培養(yǎng)基沒(méi)有檢出的一部分患者。出現(xiàn)假陽(yáng)性的93例患者中，雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果均為實(shí)際菌落數(shù)，這說(shuō)明雙相培養(yǎng)基在培養(yǎng)含菌量極低的痰標(biāo)本時(shí)具有更高的陽(yáng)性檢出率。盡管兩種培養(yǎng)基的ROC曲線下面積不是太高，主要因?yàn)楸容^對(duì)象是臨床診斷。結(jié)核病的臨床診斷主要依據(jù)臨床癥狀和體征，結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)、病理學(xué)、影像學(xué)等檢查的證據(jù)[21]。雖然細(xì)菌學(xué)診斷是結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但痰涂片的陽(yáng)性檢出率較低，痰培養(yǎng)雖可提高陽(yáng)性檢出率，但也不足50%[22]。根據(jù)2018年全球結(jié)核病報(bào)告，我國(guó)2017年活動(dòng)性肺結(jié)核患者病原學(xué)陽(yáng)性率為32%[23]。《“十三五”全國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃》[24]中提出肺結(jié)核患者病原學(xué)陽(yáng)性率需達(dá)到50%以上。本研究在活動(dòng)性肺結(jié)核患者中，涂片陽(yáng)性率為30.19%，涂片加羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)陽(yáng)性率為43.11%，涂片加雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)陽(yáng)性率為46.34%，使用雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)陽(yáng)性率已經(jīng)更接近50%的目標(biāo)，也提示需要采取結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)來(lái)進(jìn)一步提高病原學(xué)陽(yáng)性率。

雙相培養(yǎng)基較羅氏培養(yǎng)基報(bào)陽(yáng)時(shí)間縮短10 d，略高于文獻(xiàn)報(bào)道的縮短6～9.3 d[10,25-27]。而且在不同陽(yáng)性級(jí)別的痰標(biāo)本中也表現(xiàn)出更短的報(bào)陽(yáng)時(shí)間，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著涂片陽(yáng)性級(jí)別升高，雙相培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)時(shí)間隨之更短，報(bào)陽(yáng)時(shí)間與標(biāo)本中的活菌量有關(guān), 活菌量越大, 平均報(bào)陽(yáng)時(shí)間越短[28]。本研究證實(shí)了這一結(jié)論。

雙相培養(yǎng)基較羅氏培養(yǎng)基具有更高的陽(yáng)性檢出率，診斷價(jià)值較高，報(bào)陽(yáng)時(shí)間明顯縮短，是一種可以作為結(jié)核病臨床診斷的參考方法，在我國(guó)基層實(shí)驗(yàn)室有一定推廣應(yīng)用價(jià)值。

志謝湖南省邵陽(yáng)市結(jié)核病防治醫(yī)院、廣西壯族自治區(qū)北海市結(jié)核病防治院、河南省南陽(yáng)市第六人民醫(yī)院工作人員在研究現(xiàn)場(chǎng)所付出的努力與辛勤工作！