沉默Chk2基因?qū)ADS阻滯人胃癌BGC823細(xì)胞G2/M期的影響

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(1.湖南省腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省胃癌研究中心，南華大學(xué)腫瘤研究所， 湖南 衡陽(yáng) 421001；2.湖南省中醫(yī)高等專科學(xué)校附屬一醫(yī)院腫瘤科)

研究表明，在對(duì)DNA損傷的反應(yīng)中，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)可在G1期、S期和G2/M過(guò)渡中激活，檢查點(diǎn)激酶1(checkpoint kinase1，Chk1)與檢查點(diǎn)激酶2(checkpoint kinase 2，Chk2)是G2/M期檢查點(diǎn)的兩個(gè)關(guān)鍵激酶。近年來(lái)，采取DNA損傷藥物與靶向Chk1/2藥物相結(jié)合，顯著提高治療效果[1]。

二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)是一種從大蒜中提取的脂溶性有機(jī)硫化合物，可抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖[2]。本實(shí)驗(yàn)室前期工作表明，DADS能明顯抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖和阻滯G2/M期，與激活p38通路、抑制ERK/AP-1通路有關(guān)[3-4]。并且，Chk2基因高表達(dá)可促進(jìn)DADS阻滯MGC803細(xì)胞G2/M期的作用[5]。本文研究沉默Chk2基因?qū)ADS阻滯人胃癌BGC823細(xì)胞G2/M期的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑人低分化胃癌細(xì)胞株BGC823由本實(shí)驗(yàn)室保存。DADS為Fluka公司產(chǎn)品。BCA蛋白定量試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品。siRNA轉(zhuǎn)染試劑、siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基及Chk2 siRNA、Lipofectamine2000、Chk2、Cyclin B1與β-actin抗體及ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Santa Cruz公司。Cdc25C鼠單克隆抗體(NeoMarkers公司)。新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程公司。引物利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)BGC823細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于37 ℃，含5%CO2，恒濕恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶后傳代，0.175%胰蛋白酶消化3 min，傾去胰酶，加適量含血清培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，按所需濃度接種。轉(zhuǎn)染Chk1 BGC823細(xì)胞用含200 μg/mL G418、10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于37 ℃，含5%CO2，恒濕恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，鋪滿培養(yǎng)瓶后傳代，傳代時(shí)常規(guī)吸去培養(yǎng)液，用0.175%胰蛋白酶消化3 min，傾去胰酶，加適量含血清培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，按所需濃度接種。

1.3 siRNA沉默Chk2基因Chk1小干擾RNA (siRNA)按照說(shuō)明書，3×105/孔BGC823細(xì)胞接種于6孔板中，siRNA稀釋于siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，與Lipofectamine2000混合，在siRNA最終濃度為100 nmol/L時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，非特異性siRNA轉(zhuǎn)染作為對(duì)照。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)RNA干擾的效果。設(shè)計(jì)并合成q-PCR引物：Chk2：F 5-′CTCG GGAGTCGGATGTTGAG-3′，R 5′-GA GTTTGGCAT CGTGCTGGT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度142 bp；β-actin：F 5′ATCTGGCACCAC ACCT3′，R 5′CGTCATACTCCTGCTT3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度203 bp。各基因擴(kuò)增條件：Chk2：95 ℃ 5 min，35個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，86.5 ℃ 5 s；GAPDH：95 ℃ 5 min，35個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，86 ℃ 5 s。檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，對(duì)待測(cè)樣品的目的基因進(jìn)行定量。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)收集培養(yǎng)細(xì)胞，離心1 000 rpm×5 min，用預(yù)冷PBS液重懸細(xì)胞，離心1 000 rpm×5 min，重復(fù)一次；將收集的細(xì)胞用4 ℃預(yù)冷的75%乙醇固定細(xì)胞，冰盒送檢。樣本上機(jī)前，將乙醇固定的細(xì)胞離心洗滌，去上清，搖勻；加RNA酶0.5 mg/mL 50 μL，37 ℃水浴30 min；加碘化丙啶1 mg/mL 50 μL，振蕩混勻，置冰箱30 min；300目尼龍網(wǎng)濾過(guò)，計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，上機(jī)進(jìn)行細(xì)胞周期和DNA含量分析。

1.5 Western blot檢測(cè)收集1×106個(gè)細(xì)胞，加100 μL裂解液，冰上裂解1 h，低溫高速離心收集蛋白，BCA蛋白定量測(cè)定蛋白濃度。每孔加30 μg蛋白，以5∶1體積與5×SDS緩沖液混合，100 ℃ 5 min，10%SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST(Tris-HCl 20 mmol/L，NaCl 137 mmol/L含0.1%Tween-20)封閉2 h，TBST洗膜3次，一抗37 ℃孵育2 h，TBST洗3次，每次15 min，二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光劑檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡，薄層掃描儀測(cè)定印跡區(qū)帶的光密度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗(yàn)或one-way ANOVA比較組間差異，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1流式細(xì)胞檢測(cè)根據(jù)文獻(xiàn)[6]，采用15 mg/L DADS作用BGC823細(xì)胞12 、24 、36 、48 h后，G2/M期細(xì)胞分別為20.4%、39.5%、32.8%、20.03%較對(duì)照組的10.1%、16.6%、14.7%、13.5%均明顯增加(P<0.05)，表明DADS可呈時(shí)間依賴性阻滯BGC823細(xì)胞G2/M期(表1)。

2.2 Chk2沉默對(duì)BGC823細(xì)胞Chk2表達(dá)的影響為了確定Chk2是否影響DADS誘導(dǎo)G2/M阻滯，通過(guò)RNA干擾沉默Chk2基因，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、空載體組與Chk2沉默組。q-PCR與Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，BGC823細(xì)胞經(jīng)Chk2 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，Chk2 mRNA與蛋白表達(dá)下調(diào) (P<0.05)(圖1，圖2)。

表1 DADS對(duì)BGC823細(xì)胞周期的影響(n=3)

與對(duì)照組相同時(shí)間比較，aP<0.05

圖1 Chk2沉默對(duì)BGC823細(xì)胞Chk2 mRNA表達(dá)的影響1：對(duì)照組;2：空載體組;3：si-Chk2沉默組 與對(duì)照組和空載體組比較，*P<0.05

圖2 Chk2沉默對(duì)BGC823細(xì)胞Chk2蛋白表達(dá)的影響1：對(duì)照組;2：空載體組;3：si-Chk2沉默組 與對(duì)照組和空載體組比較，*P<0.05

2.3 Chk2沉默對(duì)DADS阻滯BGC823細(xì)胞G2/M期的影響結(jié)果顯示，Chk2沉默組G2/M期細(xì)胞15.4%較空載體組14.2%差異無(wú)顯著性(P>0.05)。經(jīng)DADS處理后，Chk2沉默組與對(duì)照組G2/M期細(xì)胞分別為31.1%與33.2%(P>0.05)，但是，較未處理Chk2沉默組與對(duì)照組明顯增加 (P<0.05，見圖3)。表明Chk2沉默對(duì)BGC823細(xì)胞G2/M無(wú)影響，也不影響DADS阻滯BGC823細(xì)胞G2/M的作用。

圖3 Chk2沉默對(duì)DADS阻滯BGC823細(xì)胞G2/M期的影響

2.4 Chk2沉默對(duì)DADS作用BGC823細(xì)胞Cdc25C與cyclin B1表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Chk2基因沉默后，CDC25C和CyclinB1表達(dá)較對(duì)照組差異無(wú)顯著性(P>0.05)。但是，15 mg/L的DADS處理對(duì)照組與Chk2沉默組后，CDC25C和CyclinB1表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低 (P<0.05)，而DADS處理對(duì)照組與Chk2沉默組之間差異無(wú)顯著性(P>0.05，見圖4)。表明沉默Chk2對(duì)CDC25C和CyclinB1表達(dá)沒有影響，而且對(duì)DADS作用也沒有影響。

圖4 Chk2沉默對(duì)DADS作用BGC823細(xì)胞 Cdc25C與cyclin B1表達(dá)的影響1：對(duì)照組；2：DADS組;3：si-Chk2組;4：si-Chk2+DADS組 與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 討 論

大量研究表明，許多靶向Chk1/2藥物可阻滯腫瘤細(xì)胞G2/M，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。乙酰-大萼香茶菜素B (A-mac B)可激活Chk1/2-Cdc25C-Cdc2/cyclin B1通路誘導(dǎo)G2/M阻滯[7]。Rabdocoestin B通過(guò)上調(diào)Chk1/Chk2-Cdc25C通路，下調(diào)Cdc2/Cyclin B1表達(dá)，抑制G2的過(guò)渡，阻滯食管癌細(xì)胞G2/M[8]。中草藥廣防風(fēng)中分離出的ovatodiolide可激活DNA損傷的相關(guān)分子ATM/ATR和CHK1/CHK2，下調(diào)Cyclin B1和CDC25C阻滯肺癌細(xì)胞G2/M[9]。Jaridonin可顯著誘導(dǎo)胃癌MGC803細(xì)胞中G2/M期阻滯，其機(jī)制與激活A(yù)TM和Chk1/2以及Cdc2和CDK2磷酸化失活有關(guān)[10]。二氫楊梅素通過(guò)Chk1/Chk2/Cdc25C通路阻滯G2/M與抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖[11]。然而，DADS阻滯MGC803細(xì)胞G2/M是通過(guò)ATR/Chk1/CDC25C/cyclin B1通路，作用靶點(diǎn)是Chk1，與Chk2無(wú)關(guān)[5]。

研究證明，Chk2在阻滯腫瘤細(xì)胞G2/M起著重要作用。SMYD3缺失可以通過(guò)ATM-Chk2/p53-Cdc25C途徑抑制胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖，并阻斷G2/M期[12]。硫代苯醚噠嗪酮化合物IMB5043通過(guò)激活A(yù)TM/Chk2通路阻滯G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞遷移和侵襲[13]。醉茄素A的亞型W-2b以劑量依賴性的方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞Chk2磷酸化，阻滯G2/M期和上調(diào)p21表達(dá)[14]。curcumin通過(guò)靶向ATM/Chk2/p53信號(hào)通路誘導(dǎo)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌凋亡、阻滯細(xì)胞周期與抑制血管生成，發(fā)揮其抗腫瘤活性[15]。鬼臼素類似物4DPG提高p-Chk2、Chk2和抑制Twist1活性，阻滯G2/M期和上調(diào)p21表達(dá)，顯著降低腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[16]。引人注目的是，大蒜提取物通過(guò)激活A(yù)TM和Chk2，抑制Cdc25C和Cdc2磷酸化，下調(diào)cyclin B1和上調(diào)p21WAF1，顯著抑制膀胱癌細(xì)胞增殖與阻滯G2/M期[17]。DATS通過(guò)ATM-Chk2-Cdc25c-p21WAF1-Cdc2信號(hào)通路阻滯膀胱癌EJ細(xì)胞G2/M期與抑制生長(zhǎng)[18]。

本研究的目的是確定沉默Chk2在DADS阻滯BGC823細(xì)胞G2/M發(fā)揮什么作用。結(jié)果顯示，DADS處理前后，Chk2沉默組G2/M期細(xì)胞較對(duì)照組差異無(wú)顯著性。Chk2基因沉默后，CDC25C和CyclinB1表達(dá)較對(duì)照組無(wú)明顯差異。但是，DADS處理Chk2沉默組后，CDC25C和CyclinB1表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低，而DADS處理對(duì)照組與Chk2沉默組之間差異無(wú)顯著性。表明Chk2沉默對(duì)BGC823細(xì)胞G2/M與CDC25C和CyclinB1表達(dá)無(wú)影響，而且對(duì)DADS作用也沒有影響。

綜上所述，Chk2沉默對(duì)人胃癌BGC823細(xì)胞G2/M阻滯與DADS作用沒有影響，DADS阻滯G2/M的檢查點(diǎn)不是Chk2。但是，大蒜提取物與DATS可通過(guò)ATM-Chk2-Cdc25c通路阻滯膀胱癌細(xì)胞G2/M，而Chk2沉默卻對(duì)DADS阻滯BGC823細(xì)胞G2/M與CDC25C和CyclinB1表達(dá)無(wú)影響，這是否是由于作用的腫瘤細(xì)胞不同或DADS有機(jī)硫化合物的作用機(jī)制不同，闡明這個(gè)問題尚待進(jìn)一步探討。