西藏高原酸奶中乳酸菌產抑菌物質的抑菌活性及抑菌機制

杜 琨

(武警工程大學裝備管理與保障學院，陜西西安 710086)

目前，影響人類公共健康和食品安全的最大食源性疾病是由細菌污染引起的，其中引起食源性疾病的主要病原菌有金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)和大腸桿菌(Escherichiacoli)[1-2]。細菌污染食品后不但降低了食品的營養價值和品質，還會產生一些令人難以接受的感官性狀和毒素。目前，我國常用的傳統食品防腐劑分為有機防腐劑和無機防腐劑2種，有機防腐劑主要有山梨酸鉀、苯甲酸鈉、對羥基甲酸酯類等；無機防腐劑主要有亞硫酸鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽和二氧化硫等。傳統防腐劑由于具有潛在的致癌性、致畸性、環保問題等，其安全性正越來越受到人們的關注。隨著人們生活水平的不斷提高和對健康的日益關注，人們對防腐劑類的食品添加劑在安全性能上提出了更高的要求，所以，人們開始把目光投向天然防腐劑。天然防腐劑和化學合成防腐劑相比具有無毒、無副作用并有一定的保健作用等特性，己經成為國內外研究的重要課題。此外，天然防腐劑不僅為食品工業所需，醫藥、化妝品、飼料等行業均需要天然防腐劑，因此其市場前景非常好[3-4]。

高原產酸奶中含有多種天然抑菌物質，具有維持腸道菌群平衡、提高機體免疫力、促進營養物質的吸收等功能[5]。本試驗擬從我國西藏地區高原自然發酵酸奶中定向篩選產抑菌物質的乳酸菌，通過優化發酵條件，生產抑菌物質，并進行純化、鑒定[6-7]。目前，關于酸奶中獲得的抑菌物質對微生物作用機制的報道很少。本研究選取金黃色葡萄球菌為試驗對象，研究乳酸菌產抑菌物質抑制細菌生長的作用機制，旨在為乳酸菌產抑菌物質在飼料、食品、藥品等領域的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌產抑菌物質：由筆者所在實驗室從高原酸奶中分離得到乳酸菌，經添加營養物質、發酵優化、分離、純化和冷凍干燥等制成乳酸菌產抑菌物質凍干粉[6-7]。將乳酸菌產抑菌物質凍干粉配制成濃度為3.13 mg/mL的水溶液，于4 ℃保藏備用。指示菌：金黃色葡萄球菌，由陜西師范大學食品工程與營養科學學院微生物發酵實驗室提供；乳酸菌產抑菌活性物質的保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、溶血性鏈球菌(Streptococcus)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、乙醇酵母(alcoholyeast)、啤酒酵母(SaccharomycescerevisiaeHansen)等由西北農林科技大學提供；小腸結腸炎耶爾森氏菌、番茄灰霉病病菌、香蕉炭疽病病菌、水稻紋枯病病菌、油菜菌核病病菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、黑曲霉、黃曲霉等由陜西省微生物研究所提供。細菌培養采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，酵母菌培養采用酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(簡稱YPG培養基)，霉菌培養采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(簡稱PDA培養基)[8]。

TQHZ-2002A恒溫振蕩培養箱，太倉市華美生化儀器廠；GHP-250恒溫培養箱，揚州市三發電子有限公司；SB-3S-1 無菌操作臺，上海博迅實業有限公司；CL-32L高壓滅菌鍋，上海醫用核子儀器廠；CR21G冷凍離心機，日本日立；DELTA-320 pH計，Mettler-Tlelod公司；調溫電熱器，通州市申通電熱器廠；PL-2002電子天平，Mettler-Tlelod公司；SPM-9500J3型原子力顯微鏡(atomic force microscope，簡稱AFM)，日本島津公司。

本試驗于2013年9月至2015年6月在陜西師范大學食品工程與營養科學學院微生物發酵實驗室和畜產品實驗室完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 原子力顯微鏡下觀察乳酸菌產抑菌物質 原子力顯微鏡具有分辨率高、原位成像、不破壞樣品、對材料的導電性無要求等特點，可以獲得測量材料的微觀形貌、表面粗糙度、表面電荷和微觀力學性能等參數，是微觀分析的常用工具之一。

(1)AFM制樣。將乳酸菌產抑菌物質加入雙蒸水中溶解，配成1 μg/mL溶液，取5 μL濃度為1 μg/mL的溶液，滴在新剝離的云母表面上，于室溫、空氣中干燥后，用原子力顯微鏡觀測[9]。

(2)原子力顯微鏡觀測。在室溫大氣環境中測量乳酸菌產抑菌物質的分子形態。采用輕敲模式，氧化硅探針材料為Si3N4(微懸臂長為200 μm，彈性系數為0.12 N/m)，所有力-距離曲線均采用同一探針在同一載荷速率下測量得到。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定[10]用二倍稀釋法對100 mg/mL乳酸菌產抑菌物質溶液進行稀釋，吸取2 mL乳酸菌產抑菌物質溶液和18 mL融化的培養基同時放入滅菌的培養皿中，調節pH值為2.5，充分混勻，使乳酸菌產抑菌物質的最終濃度為0.79、1.57、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 mg/mL 8個梯度。待冷卻后，用接種針劃線在培養基上涂上濃度為106CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液，以無菌水作為空白對照組，每個濃度設3個重復。觀察菌體的生長情況，培養皿中無菌生長的，此皿的乳酸菌產抑菌物質濃度即為其MIC值。

1.2.3 乳酸菌產抑菌物質抑菌譜測定[11]將供試菌種接種培養(細菌在37 ℃培養24 h，酵母菌和霉菌在28 ℃培養 48～72 h)后，用血細胞計數板對活化的菌液進行計數，用無菌水將菌液濃度調至106CFU/mL。

將配制好的培養基及培養皿、直徑約為6 mm的濾紙片放入高壓鍋內進行滅菌(121 ℃，25 min)，滅菌后取出，放入無菌操作室內冷卻至約50 ℃時，點燃乙醇燈，在乙醇燈周圍進行操作。將培養基倒入已滅菌培養皿中，在無菌條件下用移液槍吸取適量菌懸液于培養皿中，用刮鏟均勻涂布；用鑷子夾取浸過乳酸菌產抑菌物質的濾紙貼于接種了菌種的培養皿中，設3次重復，以無菌水作為空白對照。細菌在恒溫37 ℃條件下培養24 h，酵母菌和霉菌在恒溫28 ℃條件下培養 48～72 h，采用十字交叉法測量抑菌圈的直徑。

1.2.4 不同影響因素對乳酸菌產抑菌物質抑菌活性的影響

1.2.4.1 pH值對抑菌作用的影響 以金黃色葡萄球菌作為供試菌種，用酸堿溶液調節待測乳酸菌產抑菌物質溶液的pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。以未調pH值的乳酸菌產抑菌物質作為對照(pH值為3.65)，于37 ℃培養箱中培養金黃色葡萄球菌24h，測量抑菌圈直徑。

1.2.4.2 溫度對乳酸菌產抑菌物質抑菌作用的影響 將待測乳酸菌產抑菌物質分為2組，A組分別置于70、80、90、100 ℃ 水浴及121 ℃高壓濕熱條件下處理30 min后調節pH值為2.5，以金黃色葡萄球菌為供試菌種，測量抑菌圈直徑；B組先調pH值為2.5，再分別置于70、80、90、100 ℃水浴及 121 ℃ 高壓濕熱條件下處理30 min，以室溫下不經處理的乳酸菌產抑菌物質作為對照，于37 ℃培養箱中培養金黃色葡萄球菌24 h，以金黃色葡萄球菌作為指示菌，測量抑菌圈直徑。

1.2.4.3 不同NaCl、蔗糖濃度對抑菌作用的影響 在乳酸菌產抑菌物質水溶液中加入NaCl并分別調節其濃度為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%；加入蔗糖并分別調節其濃度為0、1%、2%、3%、4%、5%，以金黃色葡萄球菌作為指示菌，以無菌水作為空白對照，于37 ℃培養箱中培養金黃色葡萄球菌24 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.4.4 紫外線照射對乳酸菌產抑菌物質抑菌作用的影響 將乳酸菌產抑菌物質水溶液分別在紫外線下照射5、10、15、20、25、30 min。以金黃色葡萄球菌作為指示菌，以無菌水作為空白對照，于37 ℃培養箱中培養金黃色葡萄球菌24 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.5 乳酸菌產抑菌物質的抑菌機制

1.2.5.1 乳酸菌產抑菌物質對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響 將金黃色葡萄球菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養液中進行振蕩培養，用血球計數板計數，取生長量為106CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液作為指示菌懸液，向其中加入濃度為MIC的乳酸菌產抑菌物質，每隔3 h取樣，然后用紫外-可見分光光度計在650 nm下測定D650 nm，連續測定36 h。以時間為橫坐標、以抑菌圈直徑和D650 nm為縱坐標，分別繪制對照組和加藥組的生長曲線。

1.2.5.2 乳酸菌產抑菌物質對金黃色葡萄球菌細胞形態的影響 用2.5%戊二醛固定細菌后，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7.2)洗滌3次，每次10 min；然后依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇梯度脫水各1次，每次10 min；再用無水乙醇脫水2次，每次10 min；用包埋劑Epon 812定向包埋，用超薄切片機進行超薄切片，厚度為 50 nm 左右；用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色各30 min，再用蒸餾水沖洗，于37 ℃烘干，用H-600透射電子顯微鏡觀察、拍照[12]。

2 結果與分析

2.1 原子力顯微鏡觀察分析

由圖1可以看出，在室溫下觀測乳酸菌產抑菌物質的分子圖像清晰、穩定，分子形貌呈現出大小不一的樹狀結構，支鏈直徑在6.01～21.46 nm之間，鍵高為65.19～77.35 nm。此外，從對乳酸菌產抑菌物質的AFM三維形貌觀察可以看出，其樹狀結構上具有很多峰狀突起，推測乳酸菌產抑菌物質分子鏈可能具有較多分支。經綜合分析，推測乳酸菌產抑菌物質可能通過肽鍵先形成雙螺旋，后纏繞形成較大的聚集體。

2.2 乳酸菌產抑菌物質最小抑菌濃度的測定結果

由表1可以看出，當乳酸菌產抑菌物質的濃度為 3.13 mg/mL時，金黃色葡萄球菌不能生長，而當乳酸菌產抑菌物質的濃度為1.57 mg/mL時，有金黃色葡萄球菌生長，因此可知，乳酸菌產抑菌物質對金黃色葡萄球菌的MIC為 3.13 mg/mL。

表1 乳酸菌產抑菌物質抑制金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度(MIC)的測定結果

注：“-”“+”分別表示無、有金黃色葡萄球菌生長。

2.3 乳酸菌產抑菌物質的抑菌譜測定結果

本試驗選擇革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、鏈球菌、保加利亞乳桿菌、單增李斯特菌、藤黃微球菌)、革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、熒光假單胞菌)、酵母菌和霉菌作為檢測指示菌，測定乳酸菌產抑菌物質對各指示菌的抑菌活性。從表2可以看出，乳酸菌產抑菌物質具有較廣的抑菌譜，對革蘭氏陽性菌有很好的抑制作用，對部分革蘭氏陰性菌有抑制作用，對酵母菌、霉菌沒有抑制作用。從表2還可以看出，乳酸菌產抑菌物質對食源性致病菌，如金黃色葡萄球菌和小腸結腸炎耶爾森氏菌等具有很好的抑制作用；對食品腐敗菌，如藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌等的抑制作用較好，顯示其在食品防腐作用中的應用潛力。但是乳酸菌產抑菌物質對霉菌和酵母菌沒有作用。此外，乳酸菌產抑菌物質對很多植物的致病菌如香蕉炭疽病病菌、番茄灰霉病病菌、水稻紋枯病病菌、油菜菌核病病菌等有很好的抑制作用，說明它在植物疾病的防治方面也有很好的作用。

表2 乳酸菌產抑菌物質的抑菌譜

注：“-”表示抑菌圈直徑<0.6 cm；“+”表示抑菌圈直徑為 0.6～1.1 cm；“++”表示抑菌圈直徑為1.1～1.4 cm；“+++”表示抑菌圈直徑>1.4 cm。

據報道，乳酸乳球菌菌株產生的抗菌物質主要對革蘭氏陽性菌起作用[13-14]。而本研究中的乳酸菌產抑菌物質不但對革蘭氏陽性菌有效，而且對部分革蘭氏陰性菌也有較強的抑制作用，顯示其在食品保鮮防腐和植物疾病防治方面的應用潛力，也說明乳酸菌產抑菌物質具有較廣譜的抗菌活性。

2.4 乳酸菌產抑菌物質抑菌活性影響因素研究

2.4.1 pH值對乳酸菌產抑菌物質活性的影響 由圖2可以看出，在pH值為2～6的范圍內，隨著pH值的上升，乳酸菌的抑菌活性逐漸降低，當pH值為6.0～7.0時，乳酸菌產抑菌物質活性很低，這與Jiang等報道的結果[4，15]相似。因此可知，乳酸菌產抑菌物質適用于酸性食品或在酸性條件下食品的防腐保存。

2.4.2 不同溫度處理對抑菌作用的影響 如圖3所示，對于先經不同溫度熱處理，再將乳酸菌產抑菌物質溶液的pH值調回到2.5的試驗組，隨著溫度升高，乳酸菌產抑菌物質的抑菌活性迅速下降，當溫度達到100 ℃時基本失去活性。對于先調各組的pH值為2.5，再經不同溫度熱處理的試驗組，隨著處理溫度的升高，抑菌活性逐漸降低，整個變化過程緩慢，當處理溫度達到100 ℃時，其抑菌活性略有降低，這與許多關于乳酸菌產細菌素的理化特征的報道相符，細菌素是蛋白類物質，而一般高溫會使蛋白質變性，使蛋白類細菌素失活，但是由于小分子肽類物質的分子量要比蛋白質小，結構相對簡單，因此其穩定性和抗性比蛋白質強，由此推測乳酸菌產抑菌物質可能屬于小分子肽類物質[16]。

2.4.3 不同NaCl、蔗糖濃度對抑菌作用的影響 從圖4、圖5可以看出，在乳酸菌產抑菌物質溶液中添加鹽、糖后，能提高其抑菌活性，添加0.3%NaCl或2%蔗糖時，其抑菌活性最強，抑菌能力最強，表明0.3%NaCl或2%蔗糖對乳酸菌產抑菌物質的活性具有一定的增強作用，這可能是由于鹽、糖能夠影響微生物生長的滲透壓，從而抑制微生物的生長。

2.4.4 紫外線照射對抑菌作用的影響 從圖6可以看出，乳酸菌產抑菌物質水溶液在經過紫外線照射后，表現出較為穩定的抑菌活性，與未經紫外線照射的乳酸菌產抑菌物質抑菌活性相比，經過紫外線照射30 min的乳酸菌產抑菌物質的抑菌圈直徑僅僅縮小了1.07 mm。說明紫外線照射對乳酸菌產抑菌物質的影響很小，乳酸菌產抑菌物質對紫外線的照射表現出較好的穩定性。可見在食品生產中，在使用乳酸菌產抑菌物質進行防腐的同時，可采用紫外線進行相應的殺菌處理。

2.5 乳酸菌產抑菌物質抑菌機制研究

2.5.1 乳酸菌產抑菌物質對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響 從圖7可以看出，對照組從3 h開始進入對數生長期，18～24 h進入細菌穩定生長期，27 h進入衰亡期。而加入MIC濃度的乳酸菌產抑菌物質后，其生長曲線發生明顯改變，金黃色葡萄球菌的生長受到抑制，菌體的生長一直處于較低水平，未出現菌體大量生長的對數期，說明乳酸菌產抑菌物質能夠抑制金黃色葡萄球菌對數生長期的菌體分裂。

2.5.2 乳酸菌產抑菌物質對金黃色葡萄球菌細胞形態的影響 由圖8-A看出，在透射電鏡下，正常的金黃色葡萄球菌細胞壁與細胞膜完整，結構緊密，細胞膜緊貼細胞壁，基本無空隙存在，胞質均勻，核區明顯。由圖8-B可以看出，經乳酸菌產抑菌物質作用3 h后，菌體有些變形、溶脹，位于細胞膜區出現一些小的空泡。由圖8-C可以看出，經乳酸菌產抑菌物質作用9 h后，細胞質皺縮，導致細胞壁與細胞膜間空隙明顯增寬，質壁分離，細胞壁疏松并出現皺褶，部分細胞壁與隔膜模糊不清，細胞質內出現許多空腔，這可能是由于乳酸菌產抑菌物質浸入細胞壁后使細胞膜蛋白遭到破壞，細胞膜收縮，從而導致細胞質固縮。可以看出，乳酸菌產抑菌物質能夠導致金黃色葡萄球菌細胞質固縮，形成空洞，使細胞代謝無法正常進行，最終導致菌體死亡。

3 結論

乳酸菌產抑菌物質抑菌或殺菌活性高，抑菌譜寬，對食源性致病菌，如金黃色葡萄球菌[17-18]、小腸結腸炎耶爾森氏菌和溶血鏈球菌等具有很好的抑制作用，對食品腐敗菌，如藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌等的抑制作用較好，顯示其在食品防腐作用中的應用潛力。此外，乳酸菌產抑菌物質對很多植物的致病菌如香蕉炭疽病病菌、番茄灰霉病病菌、水稻紋枯病病菌、油菜菌核病病菌等有很好的抑制作用，說明它在植物疾病的防治方面也有很好的作用。

乳酸菌產抑菌物質對紫外線和溫度耐受力較強，表明乳酸菌產抑菌物質所含活性較為穩定；抑菌活性受pH值影響較大，在一定范圍內，酸性越強，抑菌效果越好；NaCl和蔗糖對乳酸菌產抑菌物質的活性有一定的增強作用。出現以上結果，可能是由于鹽、糖能夠影響微生物生長的滲透壓，從而抑制微生物的生長。

抑菌機制研究顯示，經過乳酸菌產抑菌物質處理后的菌體細胞膜通透性、細胞壁及內容物均受到損害，導致細菌生長曲線發生變化。