丙酮丁醇梭菌ART18發酵葛渣水解液生產丁醇的研究

李漢廣， 周秋香， 李志敏， 吳雅晴， 馬星星， 張慶華

(1.江西農業大學生物科學與工程學院/江西農業微生物資源開發與利用工程實驗室/江西省菌物資源保護與利用重點實驗室，江西南昌 330045； 2.江西農業大學醫院，江西南昌 330045)

在全球石油消耗量逐年增加和溫室效應日趨嚴重的今天，當務之急便是尋找一種清潔、可再生的新型能源。丁醇具有燃燒值高、腐蝕性小、疏水性強、揮發性低以及可與汽油以任意比例混合等優點，因此頗受關注且被認為是理想的第2代生物質能源[1-2]。目前進行丙醇(acetone)、丁醇(buatnol)、乙醇(ethanol)發酵(簡稱丙酮丁醇發酵或ABE發酵)所用的微生物主要有丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、糖乙酸多丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)和糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)等4種[3]，這4種生產菌均為桿狀、產芽孢、具有運動特性的典型厭氧菌。丙酮丁醇產生菌的代謝過程可分為產酸階段和產溶劑階段，在產酸階段，菌體迅速生長，產生大量的氣體(H2和CO2)，同時乙酸、丁酸等有機酸大量積累，因此此時發酵液的pH值急劇下降；當發酵液的pH值下降到一定值時，丁醇及其他有機溶劑逐漸產生，ABE發酵過程進入到產溶劑階段，乙酸和丁酸逐漸被消耗，發酵液pH值逐漸回升。有研究表明，當發酵液中的丁酸濃度超過2.0 g/L時，將導致相轉型的發生，使丁酸重新被利用，發酵由此進入產溶劑階段[4]。

傳統的ABE發酵主要以玉米粉等糧食作物為發酵原料，這不僅導致傳統的ABE發酵生產成本過高，還給原本早已匱乏的糧食資源造成沉重負擔。于是，利用廉價且來源廣泛的生物作物作為原料進行丁醇等溶劑的生產成為各國科研工作者研究的熱點[5]。

葛根別稱葛條、甘葛，為豆科葛屬，有透疹、解肌退熱、生津止渴、升陽止瀉的功效。常用于表證發熱、脾虛泄瀉、項背強痛、熱病口渴、麻疹不透、陰虛消渴、熱瀉熱痢等癥狀。中國大部地區均有產，且主要分布在遼寧、江西、湖南、甘肅等地。

葛渣中含有豐富的纖維素、半纖維素等，是葛根提取葛根總黃酮、葛根精粉等有效成分后所產生的副產物[6]。但由于粗纖維含量高，因此大部分被棄置，造成了資源浪費。若以葛渣為原料進行ABE發酵，不僅解決了制藥或食品企業廢物排放等問題，而且能變廢為寶生產生物燃料。

為此，本試驗以實驗室保存的丙酮丁醇梭菌ART18(C.acetobutylicumART18)為ABE發酵菌株，對葛渣水解液進行ABE發酵的可行性進行了初步的研究，同時通過研究溫度、pH調節劑的種類和含量及活性炭添加量等對丁醇及總溶劑產量的影響，以期提高ABE(主要是丁醇)的生產強度，為以葛渣為原料進行ABE發酵的工業化提供一些較為有益的初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和接種物的準備 本試驗所用菌種為江西農業微生物資源開發與利用工程實驗室所保存的丙酮丁醇梭菌ART18(C.acetobutylicumART18)。將保存在-80 ℃的甘油管中的菌種解凍后轉移到新鮮的種子培養基中(Tryptone-yeast-extrace-acetate，TYA培養基)，在37 ℃條件下厭氧培養48～72 h，然后接種到發酵培養基中進行ABE發酵培養。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 TYA培養基 葡萄糖含量60.0 g/L，可溶性淀粉含量40.0 g/L，胰蛋白胨含量3.0 g/L，酵母提取物含量 2.0 g/L，KH2PO4含量0.75 g/L，K2HPO4含量0.75 g/L，FeSO4·7H2O含量0.01 g/L，MgSO4·7H2O含量0.2 g/L，瓊脂含量20 g/L，CH3COONH4含量3.0 g/L，pH值6.0，蒸餾定容至1 000 mL，121 ℃熱壓滅菌15 min。

1.1.2.2 發酵培養基 葡萄糖含量60.0 g/L，酵母粉含量 2 g/L，KH2PO4含量0.5 g/L，K2HPO4含量0.5 g/L，對氨基苯甲酸含量0.001 g/L，維生素B1含量0.001 g/L，生物素含量0.000 01 g/L，MnSO4·H2O含量0.01 g/L，MgSO4·7H2O含量0.2 g/L，FeSO4·7H2O含量0.01 g/L，NaCl含量 0.01 g/L，CaCO3含量3.0 g/L，121 ℃條件下熱壓滅菌 15 min[7]。

1.1.3 主要試驗設備與試劑 本試驗所用主要儀器有氣相色譜儀、小型中藥粉碎機、高速離心機等，主要試劑有生物素、硫酸鎂、硫酸亞鐵、HCl、NaOH等，以上試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 原料的預處理 將葛渣(由江西橫峰觀山月葛業股份有限公司惠贈)用機械研磨機磨成細小微粒，然后過篩選取直徑為50～100 μm的粉末，將粉末以200 g ∶2 L的比例浸泡于1%稀硫酸中，浸泡2～3 h后，將其置于121 ℃條件下熱圧滅菌60 min。冷卻至室溫，經DNS法測還原糖含量后進行濃縮，直至還原糖濃度達60～70 g/L[8]。

1.2.2 ABE發酵 用5% NaOH或5% HCl將配制好的以葛渣水解液替代碳源的發酵培養基的pH值調至6.0，分別裝入厭氧瓶中，裝液量為100 mL，然后置于滅菌鍋中在121 ℃中條件下熱壓滅菌15 min。從TYA培養基中挑出單菌落，接種于上述無菌培養液中，利用輸液針管通入加有體積分數為1%的84消毒液的水中，從而達到厭氧環境，在37 ℃條件下厭氧靜止培養88～96 h。收集發酵液測定乙醇、丙酮及丁醇等溶劑的濃度。

1.2.3 ABE擴大發酵 將ABE發酵放大到5 L發酵罐水平。發酵原料為酸水解后的葛渣水解液，裝液量為3 L，用5%NaOH或5%HCl將培養液的pH值調至6.0，37 ℃條件下厭氧發酵直到發酵結束。接種前后通入無菌高純氮氣，以除去培養基中殘存的氧氣，以保證整個發酵過程都在無氧條件下進行。在發酵過程中，無須控制發酵液pH值，靜止培養。定期收集發酵液(10 mL)進行丁醇、乙醇及丙酮等溶劑濃度的測定。

1.2.4 樣品的測定 取10 mL樣品經5 000 r/min離心 5 min，然后取上清液與1.21 g/L異丁醇溶液以1 ∶4體積比混合，將所得混合液體采用氣相色譜儀(安捷倫)進行定量檢測[9]。色譜柱為PEG-20M毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.4 μm)，檢測器溫度為240 ℃，進樣溫度為240 ℃，柱溫為90 ℃。以異丁醇作內標物進行定量檢測，進樣量為0.4 μL。

2 結果與分析

2.1 水解液殘渣對ABE發酵的影響

為探究水解液殘渣對ABE發酵的影響，本試驗以未去除水解液殘渣的水解液與去除水解液殘渣的水解液作為碳源，研究其對ABE發酵的影響，試驗結果如圖1所示。

由圖1可知，水解液殘渣的去除與否對ABE發酵具有較顯著的影響。去除水解液殘渣后，丁醇、總溶劑產量分別為5.39、10.57 g/L，與未去除水解液殘渣的丁醇、總溶劑產量相比分別提高了131.3%、108.1%。未去除殘渣的發酵液處理，不僅菌體生長緩慢，而且最終丁醇等溶劑產量也較低。一方面可能是因為未去除水解液殘渣的發酵液黏度較大，從而影響了菌體的擴散，進而使得營養物質的利用率下降，使菌體生長緩慢，最終導致溶劑產量較低；另一方面可能是由于水解液殘渣中含有毒性物質，從而影響了菌體的生長以及代謝產物的積累。

從本試驗研究結果可以得出，葛渣經酸水解后，固體殘渣的除去對ABE發酵有著至關重要的影響，即不僅可以縮短菌體生長時間，而且可以有效提高溶劑的產量。因此，在本研究的以后試驗中均以除去殘渣的水解液為原料進行ABE發酵。

2.2 溫度對ABE發酵的影響

溫度與微生物生長繁殖和產物的積累有著密切的聯系，合適的溫度不僅能夠使菌體迅速生長繁殖，同樣也能使發酵產物在最短的時間內得到最大量的積累。為提高丁醇的產量，本試驗研究了不同溫度對ABE發酵的影響(以除去殘渣的葛渣水解液為發酵原料)，試驗結果如圖2所示。

由圖2可知，在發酵過程中，低溫(33 ℃)組的產氣速度明顯比其他組要慢(結果未列出)，溶劑的產量隨溫度的升高而逐漸升高，且在37 ℃時達到最大；當溫度進一步升高時，溶劑的產量迅速降低。在低溫環境中，微生物細胞內的酶活性相對較低，菌體生長緩慢，溶劑積累少；溫度過高，微生物生長迅速，溶劑迅速積累，對菌體自身產生抑制，甚至引起菌體提前衰亡，故而溶劑產量相對難以提高。在37 ℃時，丁醇、總溶劑的產量都達到最大，具體分別為5.59、9.70 g/L。因此，接下來的發酵試驗均在37 ℃條件下進行。

2.3 不同種類和含量的pH值調節劑對ABE發酵的影響

王風芹等研究指出，恰當的緩沖介質可明顯提高碳水化合物的利用率，從而提高丁醇產量[10]。本試驗將不同的pH值調節劑[CaCO3(2.0、4.0、8.0 g/L)、Na2CO3(2.0、4.0、8.0 g/L)、NaHCO3(2.0、4.0、8.0 g/L)、KH2PO4與K2HPO4(0.50、0.75、1.0 g/L，質量比1 ∶1)]添加到發酵培養基中，以研究不同種類和含量的pH值調節劑對ABE的影響，各組中最適添加量條件下丁醇及總溶劑產量結果如圖3所示。

試驗結果表明，當碳酸鈣、碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀(1 ∶1)的添加量分別在4.0、2.0、4.0、0.75 g/L時，丁醇及總溶劑的產量在各自組中較高。添加了pH調節劑的發酵液最終pH值均高于對照組(結果未列出)。從圖3的試驗結果可知，當添加的碳酸鈣濃度為4.0 g/L時，丁醇、總溶劑的產量在各自最優條件下最高，具體分別為6.78、12.0 g/L，與對照組相比分別提高了15.5%、21.6%。

碳酸鈣的添加能明顯提高丁醇和丙酮的產量，且幾乎不影響乙醇的產量(與對照相比僅提高7.4%)。此外有其他研究也表明，Ca2+可提高丁醇的產量，其主要原因可能是由于二價離子(Ca2+)的存在提高了細胞膜蛋白的穩定性，從而提高丁醇產量[11]。

在ABE發酵過程中，當發酵液中過量地積累有機酸(乙酸與丁醇)時，ABE的發酵將受到抑制；相反，如果有機酸積累得較少，ABE的生產強度將會提高。在本試驗中，當添加了4.0 g/L碳酸鈣時，發酵結束時發酵液中殘存的總有機酸濃度最低，說明有較多的有機酸(特別是丁酸)重新轉化成丁醇，因此，在接下來的試驗中選用4.0 g/L碳酸鈣作為pH調節劑。

2.4 活性炭脫毒處理對ABE發酵的影響

分別使用1%、3%、5%活性炭對葛渣水解液進行脫毒處理，比較各處理的還原糖含量以及ABE發酵的結果，試驗結果如圖4所示。

從圖4可以看出，葛渣酸水解液經活性炭脫毒處理后進行ABE發酵，3%活性炭的脫毒效果最好，此時丁醇、總溶劑產量為7.50、12.98 g/L，與對照組相比分別提高了 11.9%、14.9%。若活性炭濃度進一步增加，溶劑濃度卻隨活性炭添加量的增加而減少。由此可推測，葛渣水解液中也存在較高濃度的發酵抑制物，而加入的活性炭可以吸附部分抑制物，從而提高ABE的發酵性能。然而，過高濃度的活性炭會造成還原糖的損失，因而降低溶劑的產量。接下來的試驗均采用3%活性炭進行脫毒處理。

2.5 ABE擴大發酵

為在更大規模上驗證上述試驗結果，在5 L發酵罐中進行擴大發酵。發酵起始條件：去除水解液殘渣的葛渣水解液為發酵原料，溫度37 ℃，用3%活性炭對水解液進行脫毒處理，另外向發酵液中添加4.0 g/L碳酸鈣，厭氧靜止培養 88 h，發酵過程無須進行pH值控制。

發酵結束時，總溶劑的濃度達到11.50 g/L，其中包括 2.50 g/L 乙醇、1.70 g/L丙酮和7.30 g/L丁醇。此時，總溶劑、丁醇的生產強度分別為0.13、0.08 g/(L·h)。從上述試驗可知，在5 L發酵罐水平利用葛渣為主要發酵原料能順利地進行ABE發酵，因此本試驗的研究結果可為以葛渣為原料工業化發酵產丁醇提供有益的初步探索。

3 討論與結論

葛渣作為葛等相關產業的副產物，一般作為工業廢棄物進行處理，由于其主要由纖維素、半纖維素及木質素等成分組成，若通過一定的前處理使之成為ABE的發酵原料，必將對拓寬ABE發酵的原料譜系以及降低原料成本有著重要的意義。為此本試驗對以葛渣水解液為發酵原料進行ABE發酵的可行性進行了初步探究，在探索葛渣經酸水解后的固體殘渣對ABE發酵的影響時發現，水解結束后去除未水解的固體殘渣能縮短菌體生長時間，同時還可以有效提高溶劑產量。當研究發酵溫度對ABE的影響時發現，在低溫環境中，微生物細胞內的酶活性相對較低，菌體生長緩慢，溶劑積累少；溫度過高，微生物生長迅速，溶劑迅速積累，因此對菌體自身產生抑制作用，容易引起菌體提前衰亡，故而溶劑產量相對難以提高。在37 ℃時，丁醇、總溶劑的產量均達到最大，具體分別為5.59、9.70 g/L。

王風芹等研究指出，恰當的緩沖介質可明顯提高碳水化合物的利用率，從而提高丁醇產量[10]。在本試驗中，當添加了4.0 g/L碳酸鈣時，發酵結束時發酵液中殘存的總有機酸濃度最低，說明有較多的有機酸(特別是丁酸)重新轉化成丁醇，而且在此條件下，丁醇、總溶劑的產量最高，具體分別為6.78、12.0 g/L，與對照組相比分別提高了15.5%、21.6%，碳酸鈣中含有CO32-，當將碳酸鈣加入到發酵液中CO32-可以起到pH值調節劑的作用，從而可有效防止發酵液pH值快速下降。同時，有研究表明Ca2+能夠提高細菌膜蛋白的穩定性，從而能增強細胞的抗逆能力，在本試驗中加入碳酸鈣能提高ABE的發酵性能，這一結果與Han等的研究結果[12-13]一致。在對纖維素原料進行水解時往往伴隨著劇烈的物理與化學反應，在這一過程中會產生一定的對菌體生長有抑制作物的物質，如糠醛、醛類、酚類化合物、乙酸等，因此在以纖維素為ABE發酵原料時，在水解完成后往往還須要一個有效的脫毒過程，以提高菌體的發酵性能[14]。在本研究中發現，以3%活性炭的脫毒效果最好，此時丁醇、總溶劑產量分別為7.50、12.98 g/L，與對照組相比分別提高了11.9%、14.9%。若活性炭濃度進一步增加，溶劑濃度隨活性炭添加量的增加而減少。由此可推測，葛渣水解液中也存在較高濃度的發酵抑制物，而加入的活性炭可以吸附部分抑制物，從而提高ABE的發酵性能。然而，過高濃度的活性炭會造成還原糖的損失，因而降低溶劑的產量。為在更大規模上研究以葛渣為原料進行ABE發酵的可行性，本研究在5 L發酵罐內進行放大培養(最優條件下)，經研究發現此時丁醇、總溶劑的生產強度分別達0.08、0.13 g/(L·h)。

生產成本過高一直是阻礙生物丁醇工業化的主要障礙之一，傳統的發酵原料如玉米、小麥及馬鈴薯等淀粉類糧食作物價格逐年攀升，若大規模應用于發酵工業，必將會給原本早已匱乏的糧食資源造成沉重負擔，我國已明令禁止利用玉米等糧食作物作為發酵原料進行生物質能源生產[15]。因此，選用廉價、易得的非糧作物或農業種植廢棄物作為原料進行生物煉制業已成為生物質能源領域的研究熱點。通過本試驗的開展，證明了丁醇產生菌(丙酮丁醇梭菌ART18)可以利用葛渣水解液進行ABE發酵，而且通過對水解產物進行脫毒等處理以及對發酵條件進行優化可提高丙酮丁醇梭菌ART18的ABE發酵性能，本研究結果可為工業化以葛渣為原料進行ABE發酵提供一些有益的初步探索。