紅豆杉內生真菌產紫杉醇的發酵條件優化研究

張 歡， 趙赟鑫， 李昭瑩， 田 露， 鄧百萬

(1.陜西省漢中市環境監測中心站，陜西漢中 723000； 2.漢中植物研究所，陜西漢中 723000； 3.陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西漢中 723000； 4.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723000)

以植物內生真菌作為藥源，其來源不會枯竭。從可持續發展的角度來看，采用微生物發酵法生產紫杉醇可望解決市場價格昂貴、供不應求的現狀，并且對于研究植物來源天然藥物的新生產途徑以及瀕危藥用植物的保護，具有十分重要的意義[1]。

近些年來，紅豆杉產紫杉醇的研究進展很快，國內外學者利用內生真菌產紫杉醇的研究報道逐漸增多，其關鍵問題在于紫杉醇產生菌的分離和發酵液中紫杉醇產量的提高。因為通過內生真菌發酵產紫杉醇達到工業化生產至少需要達到毫克級，但目前該方法產量一般只有幾百微克，主要是由于缺乏高產、穩定的適于發酵的工業菌株，以及發酵條件的不合理而限制了單位發酵液中紫杉醇的含量[2]。

pH值除了直接影響發酵過程中的各種反應速率外，還能夠改變發酵液的化學性質，間接影響目的產物的生物合成和菌體的生長。郭曉恒等對SPH-4誘變后菌株SPH-W2的生理特性進行考察，初始pH值為7.0時，代謝液中紫杉醇檢出量較高[3]。

溫度是保證酶活性的重要條件，溫度升高，生長代謝加快，反應速率加大，生產期提前，但溫度越高，酶失活越快，發酵周期縮短，菌體易于衰老，從而影響目的產物的最終產量。劉君對4株菌進行生理特性考察，發現菌株1015和菌株1006在30 ℃和25 ℃時生長較好，而菌株1002和菌株1025在 25 ℃和20 ℃時生長較好，當溫度為35 ℃和10 ℃時，4株菌菌絲生長都很緩慢，有的幾乎停止生長[4]。

此外，接種量的大小、培養時間的長短與菌種特性、發酵條件等有關，不同的微生物其發酵的接種量和培養時間是不同的。孟永宏對植物內生真菌Y3菌株的發酵條件進行了研究，結果表明以培養30 h為接種齡和2%的接種量時紫杉醇產量最高[5]。

本研究采用筆者所在課題組自行分離的紫杉醇高產菌株MetarhiziumanisopliaeLB-10[6]，在優化碳源、氮源、微量元素組成、濃度及其配比的基礎上[7]，對其發酵條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 紅豆杉內生真菌MetarhiziumanisopliaeLB-10，分離自陜西省留壩縣野生紅豆杉的高產紫杉醇內生真菌。

1.1.2 培養基 斜面培養基：PDA培養基；種子培養基：PDB培養基，馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，水1.0 L，pH值6.0～8.0；發酵液(g/L)：葡萄糖50.0 g/L，NH4NO36.0 g/L，無水MgSO40.3 g/L，KH2PO40.5 g/L，維生素B15.0×10-2g/L。

1.1.3 藥品與試劑 紫杉醇標準品(≥98%)、乙酸乙酯、甲醇、葡萄糖、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O。

1.1.4 主要儀器 高效液相色譜儀(LC 2000)、旋轉蒸發儀(RV-10，IKA)、電子天平(TB-214)、雙層恒溫干燥培養振蕩器(ZHWY-2102C)、人工氣候箱(LRH-250-G-S)、數控超聲波清洗儀(KQ-5200-DE)。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 種子液培養方法：在新鮮斜面上取 5 mm×5 mm大小已純化的菌塊，接種到裝有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，于25 ℃、180 r/min搖床上培養 3 d。

發酵培養：將培養好的種子液混勻，按3%的接種量接種到裝有330 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，每次提取所用發酵液的量為1 000 mL，于28 ℃、180 r/min搖床上培養 10 d。

1.2.2 紫杉醇樣品的提取 對培養10 d的發酵液進行抽濾，使其分離為菌液和菌絲體2個部分，菌絲用乙酸乙酯在超聲條件下萃取，菌液用乙酸乙酯通過分液漏斗萃取，分別重復3次，合并收集到的乙酸乙酯相，并用雙層濾紙過濾，濾液在40 ℃旋轉蒸發至干，樣品用甲醇溶解并且定容至10.0 mL待測。

1.2.3 紫杉醇的高效液相色譜(HPLC)檢測 紫杉醇標準品用甲醇定容至10.0 mL，配制成0.01～0.16 mg/mL的濃度梯度，繪制標準曲線。精確稱取紫杉醇標準品4.0 mg，甲醇定容至10.0 mL，從而得到母液濃度為0.4 mg/mL，將母液依次稀釋成濃度梯度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL，取20.0 μL進樣(n=5)，得到回歸方程為y=6.087 8+3 589.391 3x，r=0.999 222。建立標準曲線(圖1)，采用外標法測定內生真菌發酵產物的乙酸乙酯抽提物中紫杉醇的含量。

色譜條件：水-甲醇-乙腈(33 ∶35 ∶32)為流動相，檢測波長為228 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量為20.0 μL，柱溫：室溫，色譜柱：C18(4.6 mm×150 mm)。

紫杉醇含量的計算公式：發酵液中紫杉醇的含量 (μg/L)=甲醇中紫杉醇的含量(mg/mL)×溶解提取物所用甲醇的體積(mL)×106÷提取時所取發酵液的體積(mL)。

每次提取的紫杉醇均做3個平行樣，分別經HPLC測定并通過公式計算發酵液中紫杉醇的含量，求其平均值。

1.2.4 生物量的測定 取一定體積的發酵液離心(4 800 r/min)20 min，菌絲體用蒸餾水洗滌2次，收集菌絲體，置于80 ℃烘箱中烘干至恒質量，稱量，計算菌絲體生物量。

1.2.5 發酵條件的優化

1.2.5.1 單因素試驗 采用優化后的發酵液培養，pH值7.0，接種量3%，選取不同溫度24、26、27、28、30 ℃，以紫杉醇產量為指標，測定不同溫度對LB-10菌體紫杉醇生物合成產量的影響。

采用優化后的發酵液培養，溫度28 ℃，接種量3%，選用不同的pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以紫杉醇產量為指標，測定不同初始pH值條件對LB-10菌體紫杉醇生物合成產量的影響。

采用優化后的發酵液培養，溫度28 ℃，pH值7.0，以紫杉醇產量為指標，采用不同接種量1%、3%、5%、7%、9%，考察不同接種量對LB-10菌體紫杉醇生物合成產量的影響。

1.2.5.2 正交試驗及驗證性試驗 選取對紫杉醇積累有一定影響的溫度、pH值和接種量，各取3個水平，以紫杉醇產量為指標，進行L9(34)正交試驗及驗證性試驗。

1.2.5.3 培養時間的研究 采用優化后的發酵液培養，以紫杉醇產量和生物量為指標，在發酵培養LB-10菌體的第4～20 d，每隔1 d對LB-10的菌絲體生物量和紫杉醇產量進行詳細的檢測和記錄，研究不同培養時間對菌體生長量和代謝產物紫杉醇含量的影響。同時，尋找LB-10菌體發酵培養的對數生長末期，從而確定代謝調控物質的最佳添加時間。

2 結果與分析

2.1 最適培養溫度

為了提高菌體的生長速度和代謝產物的生產速率，在發酵過程中必須選擇最合適的溫度。由圖2可知，隨著溫度的升高，紫杉醇生物合成量顯著增加，當發酵溫度在27 ℃時，紫杉醇產量最高，在發酵溫度高于28 ℃時，隨著溫度的繼續升高，紫杉醇產量急劇下降。

試驗結果表明，溫度對紫杉醇積累有較大影響。溫度過高，會使參與紫杉醇合成的酶活性受到抑制，或者改變菌體代謝產紫杉醇的合成方向，所以選用27 ℃為最適發酵溫度。

2.2 初始pH值的選擇

不同種類的微生物對pH值的要求不同，即使是同一種微生物，在不同pH值環境下，代謝產物的合成量也不同。由圖3可知，在起始pH值為3.0時，發酵液中的菌絲體幾乎不生長，紫杉醇也未能檢測到，隨著pH值的升高，紫杉醇生物合成量逐漸增加，在pH值為7.0時，紫杉醇產量達到了最大值。繼續提高pH值，紫杉醇產量有所下降。

試驗表明，pH值對紫杉醇生物合成有較大影響，由于pH值的不同，菌體代謝合成途徑也不同。同時還發現，起始pH值在中性條件下對菌絲體大量合成積累紫杉醇有利，所以最佳起始pH值控制在7.0左右，可以使菌株發酵產紫杉醇的量達到最高。

2.3 接種量對紫杉醇產量的影響

接種量的多少與菌種特性、發酵條件等因素有關。由圖4可知，當接種量在3%～5%時，紫杉醇的產量達到了最大值；而當接種量在1%、7%、9%時，均不同程度地限制了紫杉醇的生物合成。

試驗結果表明，接種量對紫杉醇的生物合成具有明顯的影響。當接種量較小時，菌絲體生長緩慢，而菌絲體增殖消耗了大量培養基的營養物質，限制了后期紫杉醇的生物合成；當接種量過大，會導致菌絲體生長速度過快，使發酵培養基過于稠厚，導致發酵瓶內溶氧量不足，菌絲體過早地衰老，進而影響紫杉醇的生物合成。

同時，在試驗過程中還發現，接種量的大小對菌絲體生物量的影響不大。因此，接種量在3%～5%時有利于紫杉醇的生物合成，由于在適當范圍內，采用較大接種量能夠使發酵時間縮短，所以選擇5%的接種量作為最佳接種量。

2.4 發酵條件正交優化試驗

以上分析了發酵條件各組分及其不同水平對發酵的單因素影響，由于各試驗批次間差別較大，需要對各因素進行綜合考察，才能確定較優的工藝條件。正交試驗設計可通過多個因素的分析得到各因素在整體影響中的主次關系，同時能夠獲得各因素對試驗的影響規律，從而確定較優的工藝條件配比。本試驗選取對紫杉醇積累和菌體生長有一定影響的溫度、pH值和接種量，各取3個水平，以紫杉醇產量為指標，進行L9(34)正交試驗，試驗設計見表1，結果如表2、表3所示。

表1 發酵條件優化正交試驗因素水平

由表2可以看出，根據極差R值的大小，得到各因素對試驗結果影響次序為B>A>C，即pH值對產量影響最大，其次是溫度，最后是接種量。

由表3方差分析可知，溫度對紫杉醇產量的影響顯著[F0.01(2，2)>F>F0.05(2，2)]，pH值對紫杉醇產量的影響極顯著[F>F0.01(2，2)]，接種量對紫杉醇產量的影響極顯著(F>F0.01(2，2))，因此所選取3個因素對紫杉醇產量影響均顯著。

以各因素不同水平下的均值對各水平作圖(圖5)，對于因素A和因素B，其均值水平變化是先上升，后下降，因素C的均值水平變化呈上升趨勢，試驗結果表明，最佳組合為A2B2C3，即溫度27 ℃，pH值7.0，接種量5%。因此，根據正交試驗結果分析選出的最優發酵條件是溫度27 ℃，pH值7.0，接種量5%。

表2 發酵條件優化試驗設計及試驗數據

表3 發酵條件優化試驗方差分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.5 驗證性試驗

采用優化后發酵條件培養，即溫度27 ℃，pH值7.0，接種量5%。以紫杉醇產量為指標，對LB-10菌株進行搖瓶發酵驗證試驗，分別提取5次紫杉醇樣品進行HPLC檢測，試驗結果如表4所示。

表4 發酵條件優化驗證性試驗結果

結果表明，LB-10紫杉醇含量的RSD為0.13%，說明測定方法重現性好，紫杉醇含量平均值達到949.6 μg/L，產量比優化后發酵液提高了11.0 μg/L。

2.6 培養時間對紫杉醇產量的影響

發酵培養時間與菌種種類、特性和發酵條件等因素存在著必然的聯系。本試驗研究不同培養時間對LB-10菌絲體生長量和代謝產紫杉醇含量的影響，結果如表5所示。

表5 培養時間對紫杉醇產量的影響

由表5可知，發酵時間在12～16 d時，紫杉醇的產量較高，在發酵14 d時，紫杉醇合成量達到最大值，繼續延長發酵時間對目標代謝產物紫杉醇的合成積累不利，而且菌絲體開始分泌色素，對后續紫杉醇的提取也不利，所以選取最佳發酵時間為14 d，比原來的發酵時間延長4 d。

當微生物處于一個密閉系統中培養時，可以根據微生物生長速率的變化，將微生物的生長分為4個不同的階段。根據表5繪制了LB-10的菌體生長曲線和代謝產紫杉醇產量變化曲線，由圖6所示的LB-10的菌體生長曲線看出，1～3 d 時處于遲緩期，4～10 d時處于對數期，11～16 d 時處于穩定期，17～20 d時處于衰亡期。

當微生物生長到一定階段后，微生物的生長速率達到最大，此時進入了對數期，大量研究表明，由于在對數生長末期細胞已得到較好的增殖，同時，植物細胞接受代謝調控物質的信號能力最強，從而使細胞得到較好的增殖，因此在對數生長末期加入代謝調控物質的效果最好[8-11]。

結果表明，LB-10在發酵培養10 d時處于對數生長末期，在此時添加前體物質、誘導子及抑制劑會得到較好的效果，這為后續的代謝調控研究提供了生長調節劑的最佳添加時間。

3 討論與結論

在自行篩選的高產紫杉醇內生真菌MetarhiziumanisopliaeLB-10的基礎上，對其發酵產紫杉醇的工藝條件進行了研究。通過單因素試驗分析，確定了溫度、pH值、接種量的最適條件分別為27 ℃、7.0、5%。進一步采用L9(34)正交試驗分析，得到了三者在培養基中的最佳組合：A2B2C3，即溫度 27 ℃，pH值7.0，接種量5%，其紫杉醇平均含量達到 949.6 μg/L。

其次制作了高產紫杉醇內生真菌LB-10的菌體生長曲線和代謝產紫杉醇產量變化曲線，選取發酵時間為14 d，確定LB-10在培養10 d時處于對數生長末期，在此時添加前體物質、誘導子及抑制劑會得到較好的效果。

在發酵條件的研究中，發現溫度、pH值和接種量對紫杉醇的生物合成具有顯著的影響。溫度是保證酶活性的重要條件，溫度升高，生長代謝加快，反應速率加大，生產期提前，但溫度越高，酶失活越快，發酵周期縮短，菌體易于衰老，影響目的產物的最終產量；pH值除了直接影響發酵過程中各種反應速率外，還可以通過改變發酵液的化學性質，間接影響菌體的生長和代謝產物的生物合成；接種量是通過改變菌體在發酵液中的初始濃度，從而改變菌體的生長速率，進而影響了紫杉醇的生物合成。因此，為了提高菌體的生長速度和代謝產物的生產速率，在發酵過程中必須選擇最合適的溫度、pH值和接種量。

經過研究不同培養時間對菌體生長量和代謝產紫杉醇含量的影響，得到了LB-10的對數生長期，由于在對數生長末期細胞已得到較好的增殖，同時，這一時期植物細胞接受代謝調控物質的信號能力最強，從而使細胞得到較好的增殖，因此在對數生長末期加入代謝調控物質的效果最好，為后續的代謝調控研究提供了最佳添加時間。