鉤吻素己在大鼠體內的毒物動力學和組織分布研究

姬圣潔，沈保華，劉 偉

（1.司法鑒定科學研究院 上海市法醫學重點實驗室 上海市司法鑒定專業技術服務平臺，上海200063；2.復旦大學基礎醫學院法醫系，上海 200032）

鉤吻（Gelsemium elegans Benth.）別名胡蔓草、斷腸草、大茶藥、毒根等，是馬錢科胡蔓藤屬植物胡蔓藤的全株。在民間，鉤吻以外用為主，具有祛風、殺蟲止癢、消腫拔毒的療效。近年來，發現鉤吻還具有抗腫瘤[1-5]、抗焦慮[6]、消炎止痛[6-8]、免疫調節、散瞳[9]等功效。鉤吻素己（gelsenicine）是杜秀寶等人[10]首次從國產鉤吻中提取、分離并測定結構的生物堿，化學結構式如圖1。高明雅等[3]的研究表明鉤吻中三種生物堿單體鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己都顯示出對肝癌細胞HepG2的增殖抑制活性，其中鉤吻素己的效果最好。劉明等[9]發現鉤吻素己能減輕大鼠的神經性疼痛和炎癥性疼痛。而小鼠腹腔注射鉤吻素己的毒性研究顯示，其半數致死量（LD50）為0.165mg/kg，是目前為止國產鉤吻中毒性最大的生物堿[11]。由于鉤吻是劇毒植物，其治療量和中毒量相近，治療過程中發生中毒導致呼吸停止的案例已有報導，因使用不當、自殺或者惡意投毒等原因造成鉤吻中毒的事件也時有發生[12-14]，且有關鉤吻素己在生物樣品中檢測的方法學，動物染毒后的動力學、體內組織分布情況以及排泄方面的研究未見文獻報道。因此本研究以鉤吻素己為研究對象，采用單次灌胃染毒法建立大鼠急性中毒模型，探討其在大鼠體內的毒物動力學、組織分布以及排泄情況，為鉤吻中毒案件中法醫學鑒定的取材及毒理學研究的開展提供參考和依據。

圖1 鉤吻素己的化學結構

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AcquityTM Ultra Performance LC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；API 4000Q trap四極桿-線性離子阱質譜儀（美國AB SCIEX公司）；HR2860 Cucina攪拌機（荷蘭皇家飛利浦電子公司）；MD200-2氮氣吹掃儀（杭州奧盛儀器有限公司）；Centrifuge 5810R冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；TDZ4-WS離心機（上海盧湘儀離心機有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠）；BSA 124S電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）。

鉤吻素己對照品（純度99.53%）（成都曼思特生物科技有限公司）；士的寧對照品（以97%計）（中國藥品生物制品檢定所）。

甲醇、乙腈、乙酸銨（純度≥99.0%）、50%甲酸溶液均為HPLC級（美國Fluka公司）；氫氧化鈉（NaOH）、乙酸乙酯均為分析純（上海凌峰化學試劑有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為化學純（國藥集團化學試劑有限公司）；超純水由Milli-Q超純水系統制得。

空白血液（經肝素抗凝）、空白尿液和空白組織來自未經鉤吻素己染毒的大鼠。

1.2 溶液配制

鉤吻素己混懸液：量取超純水150mL置于500mL燒杯中，將稱取的1.0g CMC-Na粉末均勻撒在水面上，密封超聲2 h，待完全溶解后再加入50 mL超純水，繼續密封超聲0.5 h，即配制成0.5%的CMC-Na溶液，加入適量鉤吻素己對照品配制成一定濃度的鉤吻素己混懸液。

復溶溶液：V（甲醇）∶V［20mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸和5%乙腈）緩沖溶液］=70∶30。

1.3 實驗動物

健康清潔級SD大鼠56只，雌雄各半，體重230±30 g［（上海斯萊克實驗動物有限責任公司），實驗動物生產許可證號為SCXK（滬）2012-0002，使用許可證號為SYXK（滬）2012-0002］。本研究所進行的動物實驗符合本院倫理委員會的倫理標準，可以進行大鼠動物實驗。

1.4 方法

1.4.1 儀器條件

色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18柱（150×2.1mm，5μm）（美國安捷倫公司），柱溫為室溫，前接ZORBAX-Extend-C18保護柱；流動相包括A:20 mmol/L乙酸銨緩沖溶液 （含0.1%甲酸和5%乙腈），B:甲醇，流速為 0.2 mL/min，梯度洗脫程序為：0~0.5min10%B，0.5~0.6min10%~40%B，0.6~1.5min 40%B，1.5~1.6 min 40%~70%B，1.6~5.5 min 70%B，5.5~5.6 min 70%~10%B，5.6~8.0 min 10%B；進樣量為 5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源-正離子模式（ESI+），多反應監測（MRM），離子源電壓（IS）5500 V，離子源溫度（TEM）500 ℃，氣簾氣（CUR）30 psi，霧化氣（GS1）40 psi，輔助氣（GS2）50 psi。 化合物的兩對母離子/子離子對起定性的作用，第一對離子對用于定量分析。優化的質譜參數見表1。

表1 鉤吻素己和士的寧的質譜參數

1.4.2 動物分組、染毒與取材

通過鉤吻素己單次灌胃染毒法建立大鼠中毒模型，給藥前12 h禁食、自由飲水。試驗主要分為3組：毒物動力學組、組織分布組和排泄組。

毒物動力學組：預試驗結果表明，鉤吻素己的毒性作用在大鼠體內具有明顯的性別差異，雄性大鼠的耐受性相對更強，因此在毒物動力學試驗設計中雌雄大鼠的給藥劑量有所不同。取健康SD大鼠24只，雌雄各半。雌性大鼠隨機分為低、中、高3個劑量組，每組4只，鉤吻素己的灌胃劑量分別為0.1、0.2、0.4 mg/kg；雄性大鼠隨機分為低、中、高 3個劑量組，每組 4 只，灌胃劑量分別為 0.4、0.8、1.5mg/kg。給藥體積控制在在1~3 mL，于給藥前及給藥后2、5、10、20、30、45、60、120、180、240、360、480 min 從大鼠眼眶靜脈取血，每個時間點采血約300 μL，置于含肝素的抗凝管中，分析檢測前置于-20℃冰箱中保存。

組織分布組：取健康SD大鼠24只，隨機分為3組，每組8只，雌雄各半，每只灌胃0.4 mg/kg的鉤吻素己，分別于給藥后5、15、60 min時處死一組大鼠（4雌4雄），并立即解剖取出心、肺、脾、肝、腎、胰、腦、骨骼肌、胃、小腸、生殖器（雄性：睪丸，雌性：子宮）共11種組織。用剪刀剪開胃和小腸，去除內容物并用生理鹽水沖洗干凈，其余組織用生理鹽水快速沖洗表面，放在濾紙上吸干，然后置于-20℃冰箱中保存。用生理鹽水清洗的目的是去除組織表面的血跡，確保實驗結果的準確性。

排泄組：取健康SD大鼠8只，雌雄各半，放入代謝籠中收集空白尿液和糞便。然后灌胃給予大鼠0.4 mg/kg的鉤吻素己，置于代謝籠中收集24 h內的尿液和糞便，并測量每只大鼠的尿液體積和糞便質量。排泄物冷凍保存，待檢。

1.4.3 樣品前處理

取血液或尿液樣品0.5mL，加入2μg/mL士的寧工作液10μL、1%NaOH溶液50μL，渦旋混合1min（混合物pH值約為8.2），再加入乙酸乙酯3 mL萃取，渦旋2 min后，以離心半徑12 cm，3 000 r/min離心3min。取上清液于50℃氮吹儀上吹干，殘留物中加入復溶溶液100μL，混勻后供LC-MS/MS分析。

將生物組織剪碎并研磨成勻漿，稱取組織勻漿0.5 g，加入 2 μg/mL 士的寧工作液 10 μL、1%NaOH溶液 800 μL，渦旋混合 1 min（混合物 pH≈9），再加入乙酸乙酯3 mL萃取，渦旋3 min后，以離心半徑12 cm，3 000 r/min離心3 min。取上清液置于50℃氮吹儀上吹干，殘留物中加入復溶溶液200 μL，渦旋均勻后轉移至1.5 mL離心管中，于-20℃冰箱中放置30 min，4℃下以離心半徑9.5 cm，13 000 r/min離心2 min，取上清液供LC-MS/MS分析。

2 結果與討論

2.1 LC-MS/MS法測定生物檢材中鉤吻素己含量的方法學確認

本研究前期筆者已建立了測定生物檢材（血液、尿液、肝組織）中鉤吻素己含量的LC-MS/MS法，并進行了全面的方法學驗證[15]。結果表明鉤吻素己在 0.05~30 ng/mL（0.05~30 ng/g）范圍內線性良好，檢出限為 0.01 ng/mL（0.01 ng/g），提取回收率為67.55%~114.59%，準確度在99.00%~114.33%之間，日內、日間精密度均不超過7.48%，符合生物樣品定量檢測的要求。

2.2 給藥劑量的選擇

鉤吻素己是國產鉤吻中毒性最大的生物堿，小鼠腹腔注射的LD50為0.165 mg/kg[11]。以此為基礎，本研究通過預試驗考察了單次灌胃 4.0、2.0、1.5、1.0、0.4、0.2、0.1 mg/kg 鉤吻素己后雌雄大鼠的癥狀表現。選擇給藥劑量時需保證高、中、低三個劑量組大鼠呈現不同程度的中毒癥狀，且在整個采血時間段內未出現死亡。此外，鉤吻素己對大鼠毒性作用有明顯的性別差異，相同給藥劑量下雄性大鼠的中毒癥狀較輕，且致死劑量比雌性高，因此本研究對雌、雄性大鼠的給藥劑量不完全一致。根據預試驗結果，雌性大鼠高、中、低劑量分別選擇 0.4、0.2、0.1 mg/kg，雄性大鼠分別選擇 1.5、0.8、0.4mg/kg，以研究鉤吻素己在雌雄大鼠體內的毒物動力學差異；灌胃給予相同劑量0.4 mg/kg鉤吻素己，目的是更加直觀地比較鉤吻素己在雌雄大鼠體內的組織分布差異和排泄差異。

2.3 鉤吻素己灌胃給藥后大鼠的中毒癥狀

大鼠給予鉤吻素己灌胃給藥后，高、中劑量組大鼠（雄性大鼠給藥劑量分別為1.5、0.8 mg/kg，雌性大鼠給藥劑量分別為0.4、0.2 mg/kg）在染毒后10 min頭部開始發抖、四肢無力、叩牙，約15 min時出現頭腹貼地、叩牙頻繁、全身痙攣、呼吸困難等癥狀，約30 min后痙攣癥狀減輕，但四肢仍然無力，45 min左右中毒癥狀基本消失，逐漸恢復到正常狀態；低劑量組大鼠（雄性大鼠給藥劑量為0.4 mg/kg，雌性大鼠為0.1 mg/kg）在給藥10 min左右出現少動、頭部發抖癥狀，而后逐漸恢復正常。同等給藥劑量時雌性大鼠中毒癥狀更加明顯。

2.4 鉤吻素己灌胃給藥后在大鼠體內的毒物動力學

雌性、雄性大鼠經鉤吻素己單次灌胃染毒后，各劑量組的平均血藥濃度-時間曲線見圖2～3。通過藥物動力學數據處理軟件PKSolver2.0，采用非房室模型對鉤吻素己的血藥濃度-時間數據進行擬合分析，計算出的主要毒物動力學參數見表2～3。大鼠灌胃染毒后約10~20min，鉤吻素己血藥濃度達到峰值。雌性大鼠單次灌胃0.1、0.2 mg/kg鉤吻素己時，消除半衰期（t1/2）分別為 72.09、89.60 min，說明其在體內保留時間短、代謝速度快，而給藥劑量增大至0.4mg/kg時，t1/2為 162.60 min，與 0.1、0.2 mg/kg劑量組相比，t1/2明顯延長，且藥時曲線下面積與給藥劑量不成正比，說明在0.4 mg/kg給藥劑量下，鉤吻素己在雌性大鼠體內呈非線性動力學。雄性大鼠也出現了類似的情況，在0.4、0.8 mg/kg鉤吻素己的給藥劑量下呈線性動力學，在1.5 mg/kg給藥劑量下呈非線性動力學。這可能是由于鉤吻素己與血漿/組織蛋白質發生了結合，或者給藥劑量超過了一定限度，與代謝有關的酶的催化能力和載體的轉運能力達到了飽和，從而引起了非線性動力學過程。

另外，鉤吻素己的代謝在大鼠體內具有明顯的性別差異。灌胃給藥相同劑量，即0.4mg/kg鉤吻素己時，雌性大鼠峰濃度為8.56 ng/mL，藥時曲線下面積為 931.27（ng/mL）·min，半衰期為 162.60min，清除率為 0.40 L/（kg·min），雄性大鼠峰濃度為2.79ng/mL，藥時曲線下面積為 180.51（ng/mL）·min，半衰期為77.12 min，清除率為 4.16L/（kg·min），表明鉤吻素己在雌性大鼠體內的暴露程度大于雄性，而代謝活性卻相對較弱。

圖2 雌性大鼠單次灌胃0.1、0.2、0.4 mg/kg鉤吻素己平均血藥濃度-時間曲線

圖3 雄性大鼠單次灌胃0.4、0.8、1.5mg/kg鉤吻素己平均血藥濃度-時間曲線

表2 雌性大鼠單次灌胃0.1、0.2、0.4 mg/kg鉤吻素己的毒物動力學參數 （n=4）

表3 雄性大鼠單次灌胃0.4、0.8、1.5 mg/kg鉤吻素己的毒物動力學參數 （n=4）

2.5 鉤吻素己灌胃給藥后在大鼠體內的組織分布

大鼠單次灌胃0.4 mg/kg鉤吻素己，選擇給藥后5、15、60 min三個時間點取材，所測得的組織濃度分別代表吸收相、平衡相和消除相的藥物分布，各組織中待測物的濃度見圖4～7。鉤吻素己在大鼠體內分布迅速而廣泛，在心、肺、脾、肝、腎、胰、腦、骨骼肌、胃、小腸、生殖器（雄性：睪丸，雌性：子宮）均有不同程度的分布。從組織濃度隨時間的變化趨勢上來看，小腸、肝、胰在給藥后5 min達到最大濃度，而后隨時間的推移開始下降，這可能與灌胃的給藥方式有關，小腸是主要的吸收器官，巨大的內表面積提高了吸收效率，肝和胰是重要的消化器官，肝臟還有代謝的作用，因此給藥后短時間內的組織濃度較高，隨著消化和代謝過程的進行濃度下降；而其他組織在給藥后15 min時濃度最高，60 min時明顯下降。

從同一取材時間點不同組織的濃度差異上來看，鉤吻素己在雌性大鼠的小腸、胃、肝、胰中含量較高，其次是腎、肺、脾、子宮，在心、腦、骨骼肌中含量較低，雄性大鼠的組織分布與雌性大體一致，但生殖器官中的含量稍有不同，在小腸、胃、肝、胰中含量較高，其次是腎、肺、脾，在心、腦、骨骼肌、睪丸中含量較低。肝和胰中鉤吻素己的含量僅次于小腸和胃，但高于其他組織，因此在遇到此類中毒案件時，可優先選擇肝和胰作為送檢材料進行毒物分析。

從性別差異上來看，給予雌雄大鼠相同灌胃劑量，在相同組織中鉤吻素己的含量不同，給藥后各時間點雌性大鼠的組織濃度普遍高于雄性，大約是其組織濃度的2～5倍，再次證明鉤吻素己在雌性大鼠體內暴露量較大。性別差異可能是由于性激素通過調節鉤吻素己相關代謝酶的水平影響了其代謝過程或細胞色素P450酶介導的代謝過程有差異[16-17]，但具體機理還需要進一步深入研究。

圖4 雌性大鼠單次灌胃0.4mg/kg鉤吻素己組織濃度（n=4）

圖5 雌性大鼠單次灌胃0.4mg/kg鉤吻素己組織濃度（n=4）

圖6 雄性大鼠單次灌胃0.4mg/kg鉤吻素己組織濃度（n=4）

圖7 雄性大鼠單次灌胃0.4mg/kg鉤吻素己組織濃度（n=4）

2.6 鉤吻素己灌胃給藥后隨尿液和糞便的排泄情況

大鼠單次灌胃0.4 mg/kg鉤吻素己后，收集24 h內的尿液和糞便，檢測待測物的濃度，從而獲得鉤吻素己通過尿液和糞便的排泄情況，結果見表4～5。雌性大鼠尿液中原藥排泄量占給藥量的（0.179%±0.117%），糞便中原藥排泄量占給藥量的（0.00521%±0.00344%）；雄性大鼠尿液中原藥排泄量占給藥量的（0.0610%±0.0387%），糞便中原藥排泄量占給藥量的（0.00458%±0.00158%）。由此可知，大鼠灌胃給藥后，鉤吻素己通過尿液排泄的比例大于糞便排泄，雌性大鼠的尿液、糞便中原藥排泄比例均大于雄性大鼠，但鉤吻素己通過這兩種途徑的排泄量都非常有限。推測原藥可能通過膽汁、汗液等其他途徑排泄或者藥物在體內轉化為代謝物，因而以原型通過尿液和糞便排出的比例較低。

表4 大鼠單次灌胃給藥0.4mg/kg后尿液、糞便中鉤吻素己排泄量

表5 大鼠單次灌胃給藥0.4 mg/kg后尿液、糞便中鉤吻素己排泄量占給藥量百分比

3 結論

本文通過單次灌胃染毒法建立了鉤吻素己的大鼠急性中毒模型，研究其毒物動力學、組織分布和排泄情況，從而為鉤吻中毒案件中法醫學鑒定的取材及毒理學研究的開展提供了參考和依據。