安胃湯干預(yù)肝郁脾虛證胃潰瘍大鼠胃竇組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究

朱梓銘 唐友明 吳德坤 陳夏 韓葉芬 牛豫杰 鄭景輝

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)（南寧 530001）；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院（南寧 530011）

胃潰瘍，屬于中醫(yī)腹痛、胃脘痛、痞滿的范疇，其中氣郁傷肝，肝失條達(dá)，橫逆犯胃為主要病機(jī)的肝郁脾虛型胃潰瘍是其中常見的證型。安胃湯是在全國名老中醫(yī)林沛湘教授治療慢性胃病的驗(yàn)方基礎(chǔ)上組方而成，方中白芍柔肝健脾止痛，配以柴胡、烏藥疏肝解郁止痛，合半夏入胃，更能和胃降逆，燥濕開結(jié)，通降氣機(jī)；薏苡仁健脾除濕；少佐黃連瀉火解毒，干姜溫中逐寒，寒熱同施，辛開苦降；配合百合、炙甘草，則養(yǎng)津護(hù)胃，酸甘化陰以生津液，臨床療效顯著。但是，現(xiàn)階段中醫(yī)藥治療胃潰瘍的研究仍存在研究深度不夠，缺乏對(duì)指標(biāo)間相互關(guān)聯(lián)探索的問題［1］。為此，本課題組采用蛋白組學(xué)與生物信息學(xué)分析的手段，從機(jī)體、組織或細(xì)胞等不同層次的“整體”蛋白質(zhì)活動(dòng)的角度，揭示安胃湯治療肝郁脾虛型胃潰瘍大鼠的分子機(jī)制，力求更深入地探究中藥多靶點(diǎn)在生物分子層面的作用與聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar雄性大鼠45只，體質(zhì)量130～170 g。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處置符合科學(xué)技術(shù)部關(guān)于發(fā)布《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》（國科發(fā)財(cái)字〔2006〕398號(hào)）的要求。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（桂）2014-0002。

1.1.2藥物安胃湯藥物組成：半夏（Pinellia ternata）13 g，黃連（Coptis chinensis）5 g，干姜（Zingiber officinale）5 g，烏藥（Lindera aggregata）7 g，丹參（Salvia miltiorrhiza）15 g，百合（Lilium brownii）20 g，白芍（Paeonia lactiflora pall）20 g，薏苡仁（Semen coicis）10 g，炙甘草（Glycyrrhiza uralensis）5 g。其制劑制備由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院中藥制劑室提供。鑒定人為唐友明（主任醫(yī)師，廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院）。

1.1.3主要試劑M-PER蛋白提取試劑盒（批號(hào)KGP2100南京凱基生物有限公司），Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)WB013西安赫特生物科技有限公司），蛋白分子量Marker（批號(hào)DM111-01北京全式金生物有限公司），質(zhì)譜級(jí)胰蛋白酶（P8101-22S美國Pierce），iTRAQ 4-plex標(biāo)記試劑盒及緩沖液（批號(hào)4381557美國AB Sciex）。

1.1.4主要儀器Agilent 1100 seriesⅡ色譜分離系統(tǒng)（美國Agilent），TempoTMLC MALDI高效液相色譜儀（美國SCIEX），5800 Plus MALDI TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析儀（美國SCIEX），Zorbax Bio-SCX SeriesⅡ強(qiáng)陽性離子交換柱（美國Agilent），C18 spin column除鹽柱（The Nest Group公司），Magic C18 AQ反相柱（美國Michrom Bioresources），ProteinPilot 2.0軟件（美國SCIEX）。

1.2方法

1.2.1模型建立及切片制備

1.2.1.1模型的建立及分組給藥將45只清潔型大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和安胃湯組，每組15只，正常組每日上午3 mL生理鹽水灌服，自由飲食，共14 d；模型組與安胃湯組大鼠以多因素復(fù)合模擬中醫(yī)病因并結(jié)合乙酸法建立模型［2］：（1）每日上午以每只3 mL灌服大黃制劑液；（2）每日上午以木夾夾大鼠尾中部每只30 min；（3）每日下午將動(dòng)物負(fù)重：于大鼠尾根部纏繞重量為該大鼠體質(zhì)量10%的保險(xiǎn)絲，放入水深50 cm，水溫28℃的水槽中游泳，以力竭為度，即大鼠鼻尖沒入水面10 s。共14 d。自由飲食；（4）第15天禁食，于禁食24 h后，水合氯醛麻醉下施行剖腹術(shù)，打開腹腔，暴露胃體，在富有腺體的部位注射50%的冰乙酸0.05 mL，針頭與注射部位呈15°，回納胃體，關(guān)閉腹腔。禁食，不禁水。造模成功后第3天開始給藥治療。安胃湯組大鼠以成人等效劑量的6.17倍灌服［2］。正常組與模型組大鼠予等量生理鹽水灌胃。給藥21 d后，予以處死大鼠取胃竇組織。

1.2.1.2樣本病理切片制備將胃竇組織經(jīng)甲醛固定，逐級(jí)脫水、石蠟浸蠟包埋、連續(xù)切片和脫蠟，HE染色，封片，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，作病理學(xué)診斷。

1.2.2組織樣本同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)

1.2.2.1蛋白制備及蛋白濃度測(cè)定在兩組離心管中各加入1 mg/mL BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液各0、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μL，然后再分別加入無離子水分別為100、97.5、95、92.5、90、87.5、85 μL，混勻，配制成一系列不同濃度的BSA溶液。各管均加入Bradford工作液1 mL，混勻，靜置3 min后測(cè)定A595值，重復(fù)3次，取其平均值。以BSA蛋白量0～15 μL為縱坐標(biāo)，所測(cè)的相應(yīng)A595值的平均值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)本蛋白濃度測(cè)定：取適量的待測(cè)蛋白溶液，加實(shí)驗(yàn)用緩沖液至100 μL，再加入1 mL Bradford工作液，靜置3 min后測(cè)定A595值，重復(fù)3次，取其平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白樣品的濃度。必要時(shí)需稀釋樣品，使其濃度在所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)。

1.2.2.2蛋白的酶解和iTRAQ標(biāo)記將蛋白樣品加入胰蛋白酶消化過夜，將酶解樣品真空干燥后，溶于iTRAQ溶液緩沖液中。iTRAQ試劑114、115標(biāo)記模型組，116、117標(biāo)記安胃湯組，將標(biāo)記后的所有肽段混合，標(biāo)記后的樣品經(jīng)過C18 spin column除鹽柱除鹽，凍干。

1.2.2.3強(qiáng)陽離子柱色譜分離及反相液質(zhì)聯(lián)用分析干燥標(biāo)記后的肽段用緩沖液A（10 mmol/L KH2PO4，25%ACN，pH 2.7）復(fù)溶，進(jìn)到SCX強(qiáng)陽離子預(yù)裝柱（5 μm，2.1 mm×200 mm），以200 μL/min的速率進(jìn)行梯度洗脫，緩沖液B（10 mmol/L KH2PO4，350 mmol/L KCl，25%ACN，pH 2.7）洗脫5 min，隨后將緩沖液B的比例由5%，對(duì)應(yīng)5 min，至25%對(duì)應(yīng)40 min按20個(gè)梯度上升，收集不同梯度濃度條件下洗脫的多肽。收集到的各組份樣品稀釋后進(jìn)行反相C18柱（5 μm，77 μm×150 mm）用緩沖液B以5 min由5%到70 min上至35%梯度淋洗和點(diǎn)靶。

1.2.2.4質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)處理質(zhì)譜鑒定和相對(duì)定量分析采用5800 Plus MALDI TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析儀，用Protein Pilot 2.0聯(lián)合Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索鑒定蛋白，物種類別選擇大鼠，以滿足P＜0.05，Unused Score＞1.3且至少有1個(gè)肽段（peptides＞1）為鑒定標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告 Confidence Interval＞95%的蛋白，以組間表達(dá)差異大于20%區(qū)分差異蛋白［3］，用114、115、116、117試劑報(bào)告離子的峰面積積分進(jìn)行相對(duì)定量分析，以114、115為對(duì)照，按照116和117∶114和115的比值，即上調(diào)＞1.2，下調(diào)＜0.8，且P＜0.05的結(jié)果為差異蛋白。

1.2.3差異蛋白生物信息學(xué)分析蛋白的功能分析通過DAVID 6.8在線數(shù)據(jù)庫結(jié)合GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索注釋和富集分析。提交90個(gè)差異蛋白作為進(jìn)一步分析的蛋白集合，同時(shí)選擇相對(duì)應(yīng)的標(biāo)識(shí)符為“UNIPROB ACCESION”，勾選大鼠全基因組作為背景基因，用“Convert Tool”對(duì)基因標(biāo)識(shí)一體化，然后選擇“Functional Annotation Tool”作為分析工具，連接KEGG數(shù)據(jù)庫搜索進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)通路分析。

1.2.4蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）分析String是研究蛋白與蛋白相互作用的在線生物信息學(xué)網(wǎng)站，將本研究表達(dá)差異顯著蛋白信息導(dǎo)入，最低相互作用分值設(shè)置中度置信檔，利用Cytoscape構(gòu)建相互作用拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果

2.1胃竇組織形態(tài)學(xué)變化HE染色結(jié)果顯示，正常大鼠胃竇組織細(xì)胞排列正常，黏膜內(nèi)腺體分布均勻，形狀規(guī)整；模型對(duì)照組黏膜層腺體減少，炎性細(xì)胞大量浸潤，肉芽組織及纖維組織增生；安胃湯組黏膜腺體分布廣泛，形狀欠規(guī)整，炎性細(xì)胞散在浸潤。見圖1。

圖1 大鼠胃竇組織HE染色（×100）Fig.1 The rat gastric tissue stained by HE（×100）

2.2差異蛋白表達(dá)篩選結(jié)果安胃湯組與模型組比較，質(zhì)譜分析結(jié)果顯共鑒定出453個(gè)差異表達(dá)的蛋白。經(jīng)篩選共有90個(gè)蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表達(dá)上調(diào)的蛋白有60個(gè)，表達(dá)下調(diào)的蛋白有30個(gè)（表1）。

2.3差異蛋白GO富集分析結(jié)果經(jīng)分析共有40種生物學(xué)過程，10種細(xì)胞成分，9種分子功能GO分析顯著富集（P＜0.05），見圖2（生物學(xué)過程僅列出前10種）。

2.4差異蛋白富集信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析結(jié)果差異蛋白主要集中在80條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上，其中經(jīng)Benjamini校正P＜0.05的有包括PI3K-AKT（圖3）、JAK-STAT、Alzheimer′s Disease等在內(nèi)的62條通路（圖4）。

表1 安胃湯對(duì)胃潰瘍肝郁脾虛大鼠胃竇組織作用的上下調(diào)蛋白Tab.1 Up-regulation and down-regulation of proteins in gastric ulcer rats with syndrome of liver constraint and spleen deficiency treated by Anwei decoction

圖2 差異蛋白的GO富集分析結(jié)果Fig.2 Results of GO enrichment analysis of differential proteins

2.5PPI分析結(jié)果差異表達(dá)蛋白相互作用拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)線路清晰，中心性較強(qiáng)，分散中心及孤立結(jié)點(diǎn)較少，作用相關(guān)性較強(qiáng)，其中AKT1、AKT2、PRKAA1、PIK3CG等蛋白為網(wǎng)絡(luò)圖的互作焦點(diǎn)（圖5）。

3 討論

安胃湯具有修復(fù)胃潰瘍組織，改善幽門螺桿菌感染，降低遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率［4-5］，并減少萎縮性胃炎胃黏膜萎縮程度［6］的作用。本研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析不同層次的“整體”的蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化揭示和闡明疾病與證候的形成，藥物與機(jī)體相作用的生物學(xué)過程，是探討安胃湯干預(yù)肝郁脾虛證胃潰瘍機(jī)制的一個(gè)新切入點(diǎn)。

差異蛋白中富集分析發(fā)現(xiàn)：（1）蛋白質(zhì)磷酸化、氨基酸合成以及多種能量代謝相關(guān)的生物學(xué)過程方面較為突出，細(xì)胞成分較多集中在能量供應(yīng)的細(xì)胞器；（2）通路分析結(jié)果共得出PI3K-AKT、JAK-STAT、Alzheimer′s Disease等在內(nèi)的 62條通路，涉及不同系統(tǒng)，提示部分蛋白作用位可能恰好處于多條信號(hào)通路的重要交叉點(diǎn)或部分通路的亞級(jí)通路，有可能存在串?dāng)_機(jī)制；（3）PPI分析發(fā)現(xiàn)各節(jié)點(diǎn)聯(lián)系較強(qiáng)，分散中心及孤立結(jié)點(diǎn)較少。

圖3 PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路示意圖（標(biāo)注五星的位置為本研究中差異蛋白）Fig.3 PI3K-AKT signaling pathway（the five-star marked indicates differential proteins in our study）

圖4 差異蛋白KEGG通路富集條形圖（條形圖表示本研究中差異蛋白在該通路中的數(shù)量）Fig.4 KEGG enrichment analysis bar chart of differential protein（bar chart represents the counts of our differential protein in each pathways）

胃潰瘍發(fā)生的病因復(fù)雜，在病理形成階段，組織黏膜細(xì)胞大量破壞，發(fā)生能量代謝障礙是其共同特點(diǎn)［7］。其中通過提供必需的氨基酸原料或降低代謝消耗，可以支持胃黏膜的修復(fù)并促進(jìn)愈合［8-11］。富集分析表明多種能量代謝過程被進(jìn)一步增強(qiáng)和激活，安胃湯有可能具備了類似機(jī)制。

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖Fig.5 Protein-protein interaction and topological structure diagram of differential proteins

值得注意的是PI3K-AKT信號(hào)通路，該通路能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種機(jī)制，其中PI3K及AKT的激活可以抑制多種細(xì)胞凋亡，相反抑制其表達(dá)常用于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［12-13］。前期研究發(fā)現(xiàn)安胃湯可通過抑制PI3K-AKT表達(dá)從而對(duì)慢性萎縮性胃炎發(fā)揮療效［14］。本次結(jié)果中PRKAA1、PIK3CG、AKT2上調(diào)與治療萎縮性胃炎的調(diào)控方向相反，可能與預(yù)防胃潰瘍組織細(xì)胞凋亡、防治胃黏膜損傷有關(guān)。另外，SUN等［15］和SHEN等［16］的研究也發(fā)現(xiàn)腸三葉因子、康復(fù)新液等的胃黏膜保護(hù)作用與PI3K-AKT通路激活有關(guān)。

另外，該通路下游的Ras通路、VEGF通路、ErbB通路也顯著富集，EGF和VEGF表達(dá)量增加是促進(jìn)黏膜血管再生修復(fù)并恢復(fù)胃潰瘍損傷組織功能的機(jī)制之一［17-18］。桃葉珊瑚甙、龍膽苦甙、石斛多糖等在修復(fù)不同證型的胃潰瘍中，與EGF、VEGF表達(dá)的變化也有明顯關(guān)聯(lián)［19-22］。前期研究已證實(shí)安胃湯能促進(jìn)胃黏膜EGF的表達(dá)［5］，本次實(shí)驗(yàn)中該通路的RAF1、SOS1等蛋白的差異表達(dá)，與前期研究有一定吻合。

PI3K-AKT下游mTOR通路也被富集，許多腫瘤細(xì)胞中存在有編碼mTOR信號(hào)通路內(nèi)相關(guān)蛋白的突變基因并且存在該通路蛋白的過度激活［23］，因此抑制該通路表達(dá)對(duì)治療癌變有一定價(jià)值［24］，中藥在治療功能性消化不良、癌前病變上通過調(diào)控該通路發(fā)揮療效［25-26］。安胃湯在治療慢性萎縮性胃炎上有一定療效［4］，該結(jié)果對(duì)后續(xù)進(jìn)一步研究起到前瞻性作用。

綜上，本研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析了安胃湯治療胃潰瘍的機(jī)制，可能與調(diào)節(jié)代謝、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)黏膜再生等有關(guān)，其中PI3K-AKT通路及其下游信號(hào)通路與安胃湯前期研究機(jī)制存在部分切合，值得后續(xù)進(jìn)一步探究。