稻瘟病抗性基因Pi-b、Pi-d2、Pi-5、Pikh在寧夏水稻種質資源中的分布

張 敏， 李培富， 張銀霞

(寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021)

水稻作為世界上第二大糧食作物，世界上近一半的人口都以此為食。亞洲人口占世界人口總數一半以上，但其稻米的產量和消費量在全球的比例卻在90%以上。由稻瘟病病菌(Pyriculariagrisea)引起的稻瘟病是威脅水稻生產安全的主要障礙因素之一[1]。稻瘟病俗稱水稻癌癥，全球每年因稻瘟病損失約50億美元；我國稻瘟病年發生面積約380萬hm2，年損失稻谷約10萬t，稻瘟病流行年份重病區一般減產10%～20%，嚴重時減產40%～50%，甚至顆粒無收[2]。由于其危害面積與危害程度都日趨嚴重，已成為水稻持續高產穩產的嚴重障礙。在生產上一般通過化學防治和種植抗病品種來控制稻瘟病。化學防治手段雖然能發揮一定的作用，但在病害流行年份收效甚微，且容易造成環境污染，并不能從根本上解決稻瘟病的危害。長期生產實踐表明，在眾多的防治措施中抗病品種的培育和種植是控制該病害最為經濟、安全、有效的方法[3]。對作物品種培育而言，抗病基因的發掘與利用是抗病育種的基礎和核心。截至目前已定位的抗稻瘟病基因至少報道了69個位點共84個主效基因，但關于寧夏水稻抗稻瘟病基因的報道較少，寧夏水稻所含抗稻瘟病基因類型和抗性也尚不明確。因此，本研究利用與抗病基因Pi-b、Pi-d2、Pi-5、Pikh緊密連鎖的功能標記，對75份寧夏水稻種質資源材料的抗病基因進行分子檢測，旨在充分了解寧夏推廣品種中抗病基因的分布規律，以期為培育高產、優質、抗病的水稻品種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用來自于寧夏大學、寧夏農林科學院等寧夏選育及寧夏外引水稻品種共75份作為供試材料，分別為大胚稻、巨胚稻、耐貯藏、銀玉、江蘇省農業科學院中梗、圣稻13、圣稻14、圣稻15、圣稻16、圣稻17、臨稻11、香梗9407、圣香梗2572、綠米、小粒糯、降糖稻、大粒稻、高粱稻-1、高粱稻-2、奧326、吉梗44、LDC355、L0307S、吉2000F59、寧粳36號、寧粳43號、優育41、寧粳24號、鹽豐47、吉大6號、松遼5號、松遼6號、松遼7號、春香糯1號、Z-22、花118、花119、節11、沈稻121、2001QX-62、11NX-2417、SD-1、SD-2、2007XZ-181、法國稻、Agostone、富源4號、寧梗38號、寧梗28號、寧梗35號、寧梗40號、吉梗105、寧梗37號、花94、寧大95、2004D4、寧梗41號、寧梗33號、龍梗31、龍梗36、春優1號、墾08-1806、墾稻12、松遼08-27、通98-56、通系929、通粘1號、通院835、空育131、J-206、寧梗12號、Bertone、越光、湼羅、楊和白皮稻等。

試驗于2016年于寧夏大學遺傳育種實驗室進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物合成Pi-b、Pi-d2、Pi-5、Pikh等基因的PCR特異性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物名稱、序列、預期片段等信息如表1所示。

表1 稻瘟病抗性基因的引物序列

1.2.2 基因組DNA提取 采用十二烷基硫酸鈉法提取水稻基因組DNA，并用瓊脂糖電泳檢測DNA的質量濃度。以DNA為模板進行PCR擴增，采用20 μL反應體系：2.0 μL 20 ng模板DNA、0.4 μL 2.5 μmol/mL dNTP、0.2 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)、2.0 μL 10×Buffer(含Mg2+)、ddH2O補足20 μL。PCR反應程序：抗病基因Pi-d2、Pi-5、Pikh的擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃ 延伸1.5 min，35個循環；72 ℃延伸10 min；結束后放入4 ℃冰箱保存。抗病基因Pi-b擴增的其他條件與上述基因相同，但退火溫度為58 ℃，結束后放入4 ℃冰箱保存。擴增產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統拍照。

1.3 數據處理

利用Excel 2007對所得數據進行統計。

2 結果與分析

2.1 Pikh、Pi-5、Pi-b、Pi-d2基因功能標記的檢測

利用與抗稻瘟病基因緊密連鎖的4個功能標記基因Pikh、Pi-5、Pi-b、Pi-d2對75份寧夏水稻自育及外引材料進行抗病基因的分子檢測。由圖1可知，抗病基因Pikh功能標記為共顯性標記，攜帶Pikh抗病基因的品種能擴增出 216 bp 大小的片段條帶，不含Pikh抗病基因的品種會擴增出359 bp大小的片段條帶；由圖2可知，抗病基因Pi-5功能標記為共顯性標記，即攜帶Pi-5抗病基因的品種能擴增出 206 bp 大小的片段條帶，不含Pi-5抗病基因的品種會擴增出307 bp大小的片段條帶；由圖3可知，攜帶Pi-b抗病基因的品種能擴增出803 bp大小的片段條帶；由圖4可知，攜帶Pi-d2抗病基因的品種能同時擴增出1 009 、629 bp大小的片段條帶，不含Pi-d2抗病基因的品種只能擴增出1 009 bp大小的片段條帶。

2.2 寧夏水稻品種抗稻瘟病基因的分子檢測

對寧夏水稻品種抗稻瘟病基因進行分子檢測，由表2可知，75份材料中含有抗稻瘟病基因Pi-b的材料有37份，占供試品種總數的49.33%，含有Pikh基因的材料有56份，占供試品種總數的74.67%，含有Pi-d2基因的材料有7份，占供試品種總數的9.33%，含有Pi-5基因的材料有23份，占供試品種總數的30.67%(圖5)。其中有6份材料為雜合，分別為大胚稻、巨胚稻、小粒糯、寧粳43號、花119、Agostone，4個抗稻瘟病基因都未檢測出的材料有5份，分別為銀玉、墾08-1806、通粘1號、空育131、越光。

3 討論與結論

水稻稻瘟病抗性是一個典型的質量-數量性狀，抗病性表型既由基因控制又受環境影響[8-10]，因此傳統的育種方法很難進行準確選擇，而利用分子標記輔助選擇育種法選育抗病品種不但準確、高效、安全，而且可以在早期選擇，在抗病性育種中顯示出獨特的優勢。隨著DNA分子標記技術的發展，開發并應用于抗病基因緊密連鎖的功能標記大大提高了抗源篩選和抗病基因鑒定及育種選擇效率，已成為正確選擇抗病基因更有效的途徑[11]。近年來，國內外學者相繼對水稻品種的抗瘟基因型開展了研究。時克等利用基因自身的功能標記檢測了58個水稻品種中Pi-ta、Pi-b基因的情況及其分布狀況[12]；陳濤等利用Pi-ta、Pi-b基因的功能標記功能，對40個粳稻品種和665個粳稻新品系進行了基因型檢測，明確了抗病基因Pi-ta、Pi-b在江蘇粳稻品種中具有一定的分布，其中Pi-b基因的分布頻率較高[13]。但在稻瘟病抗性育種中，功能標記仍然存在著基因定位結果不精確或不準確等問題，且稻瘟病病菌的致病性變異較快，一般認為每隔5～7年，致病性便會出現明顯差異[14]。因此，基因聚合是培育稻瘟病持久抗性的有效方法。倪大虎等結合雜交和分子標記輔助選擇技術，經田間多代選育和抗性鑒定，將抗稻瘟病基因Pi9(t)和抗白葉枯病基因Xa21聚合到同一品系中，得到了2個抗性基因純合且農藝性狀穩定的植株[15]。

本研究利用與抗病基因Pi-b、Pikh、Pi-5、Pi-d2緊密連鎖的功能標記，對75份寧夏水稻種質資源材料的抗性基因進行了分子檢測，結果表明49.33%的檢測品種中含有抗稻瘟病基因Pi-b，74.67%的檢測品種含有稻瘟病抗性基因Pikh，以上2個基因在75份寧夏水稻種質資源品種中均廣泛存在，因此這2個基因在水稻抗病性中的利用價值不大；30.67%的檢測品種含有稻瘟病抗性基因Pi-5，9.33%的檢測品種含有稻瘟病抗性基因Pi-d2，即這2個基因是水稻檢測品種中普遍缺少的，因此，Pi-d2、Pi-5基因是今后改良寧夏水稻種質資源品種稻瘟病抗性的主要抗病基因。

表2 寧夏水稻品種抗稻瘟病基因的分子檢測結果

注：“+”表示攜帶抗病基因；“-”表示不攜帶抗病基因。