稻瘟病抗性基因Pi-b、Pi-d2、Pi-5、Pikh在寧夏水稻種質(zhì)資源中的分布

張 敏， 李培富， 張銀霞

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

水稻作為世界上第二大糧食作物，世界上近一半的人口都以此為食。亞洲人口占世界人口總數(shù)一半以上，但其稻米的產(chǎn)量和消費(fèi)量在全球的比例卻在90%以上。由稻瘟病病菌(Pyriculariagrisea)引起的稻瘟病是威脅水稻生產(chǎn)安全的主要障礙因素之一[1]。稻瘟病俗稱水稻癌癥，全球每年因稻瘟病損失約50億美元；我國稻瘟病年發(fā)生面積約380萬hm2，年損失稻谷約10萬t，稻瘟病流行年份重病區(qū)一般減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)40%～50%，甚至顆粒無收[2]。由于其危害面積與危害程度都日趨嚴(yán)重，已成為水稻持續(xù)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的嚴(yán)重障礙。在生產(chǎn)上一般通過化學(xué)防治和種植抗病品種來控制稻瘟病?；瘜W(xué)防治手段雖然能發(fā)揮一定的作用，但在病害流行年份收效甚微，且容易造成環(huán)境污染，并不能從根本上解決稻瘟病的危害。長(zhǎng)期生產(chǎn)實(shí)踐表明，在眾多的防治措施中抗病品種的培育和種植是控制該病害最為經(jīng)濟(jì)、安全、有效的方法[3]。對(duì)作物品種培育而言，抗病基因的發(fā)掘與利用是抗病育種的基礎(chǔ)和核心。截至目前已定位的抗稻瘟病基因至少報(bào)道了69個(gè)位點(diǎn)共84個(gè)主效基因，但關(guān)于寧夏水稻抗稻瘟病基因的報(bào)道較少，寧夏水稻所含抗稻瘟病基因類型和抗性也尚不明確。因此，本研究利用與抗病基因Pi-b、Pi-d2、Pi-5、Pikh緊密連鎖的功能標(biāo)記，對(duì)75份寧夏水稻種質(zhì)資源材料的抗病基因進(jìn)行分子檢測(cè)，旨在充分了解寧夏推廣品種中抗病基因的分布規(guī)律，以期為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的水稻品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用來自于寧夏大學(xué)、寧夏農(nóng)林科學(xué)院等寧夏選育及寧夏外引水稻品種共75份作為供試材料，分別為大胚稻、巨胚稻、耐貯藏、銀玉、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中梗、圣稻13、圣稻14、圣稻15、圣稻16、圣稻17、臨稻11、香梗9407、圣香梗2572、綠米、小粒糯、降糖稻、大粒稻、高粱稻-1、高粱稻-2、奧326、吉梗44、LDC355、L0307S、吉2000F59、寧粳36號(hào)、寧粳43號(hào)、優(yōu)育41、寧粳24號(hào)、鹽豐47、吉大6號(hào)、松遼5號(hào)、松遼6號(hào)、松遼7號(hào)、春香糯1號(hào)、Z-22、花118、花119、節(jié)11、沈稻121、2001QX-62、11NX-2417、SD-1、SD-2、2007XZ-181、法國稻、Agostone、富源4號(hào)、寧梗38號(hào)、寧梗28號(hào)、寧梗35號(hào)、寧梗40號(hào)、吉梗105、寧梗37號(hào)、花94、寧大95、2004D4、寧梗41號(hào)、寧梗33號(hào)、龍梗31、龍梗36、春優(yōu)1號(hào)、墾08-1806、墾稻12、松遼08-27、通98-56、通系929、通粘1號(hào)、通院835、空育131、J-206、寧梗12號(hào)、Bertone、越光、湼羅、楊和白皮稻等。

試驗(yàn)于2016年于寧夏大學(xué)遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物合成Pi-b、Pi-d2、Pi-5、Pikh等基因的PCR特異性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物名稱、序列、預(yù)期片段等信息如表1所示。

表1 稻瘟病抗性基因的引物序列

1.2.2 基因組DNA提取 采用十二烷基硫酸鈉法提取水稻基因組DNA，并用瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量濃度。以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用20 μL反應(yīng)體系：2.0 μL 20 ng模板DNA、0.4 μL 2.5 μmol/mL dNTP、0.2 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)、2.0 μL 10×Buffer(含Mg2+)、ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：抗病基因Pi-d2、Pi-5、Pikh的擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃ 延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；結(jié)束后放入4 ℃冰箱保存?？共』騊i-b擴(kuò)增的其他條件與上述基因相同，但退火溫度為58 ℃，結(jié)束后放入4 ℃冰箱保存。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pikh、Pi-5、Pi-b、Pi-d2基因功能標(biāo)記的檢測(cè)

利用與抗稻瘟病基因緊密連鎖的4個(gè)功能標(biāo)記基因Pikh、Pi-5、Pi-b、Pi-d2對(duì)75份寧夏水稻自育及外引材料進(jìn)行抗病基因的分子檢測(cè)。由圖1可知，抗病基因Pikh功能標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，攜帶Pikh抗病基因的品種能擴(kuò)增出 216 bp 大小的片段條帶，不含Pikh抗病基因的品種會(huì)擴(kuò)增出359 bp大小的片段條帶；由圖2可知，抗病基因Pi-5功能標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，即攜帶Pi-5抗病基因的品種能擴(kuò)增出 206 bp 大小的片段條帶，不含Pi-5抗病基因的品種會(huì)擴(kuò)增出307 bp大小的片段條帶；由圖3可知，攜帶Pi-b抗病基因的品種能擴(kuò)增出803 bp大小的片段條帶；由圖4可知，攜帶Pi-d2抗病基因的品種能同時(shí)擴(kuò)增出1 009 、629 bp大小的片段條帶，不含Pi-d2抗病基因的品種只能擴(kuò)增出1 009 bp大小的片段條帶。

2.2 寧夏水稻品種抗稻瘟病基因的分子檢測(cè)

對(duì)寧夏水稻品種抗稻瘟病基因進(jìn)行分子檢測(cè)，由表2可知，75份材料中含有抗稻瘟病基因Pi-b的材料有37份，占供試品種總數(shù)的49.33%，含有Pikh基因的材料有56份，占供試品種總數(shù)的74.67%，含有Pi-d2基因的材料有7份，占供試品種總數(shù)的9.33%，含有Pi-5基因的材料有23份，占供試品種總數(shù)的30.67%(圖5)。其中有6份材料為雜合，分別為大胚稻、巨胚稻、小粒糯、寧粳43號(hào)、花119、Agostone，4個(gè)抗稻瘟病基因都未檢測(cè)出的材料有5份，分別為銀玉、墾08-1806、通粘1號(hào)、空育131、越光。

3 討論與結(jié)論

水稻稻瘟病抗性是一個(gè)典型的質(zhì)量-數(shù)量性狀，抗病性表型既由基因控制又受環(huán)境影響[8-10]，因此傳統(tǒng)的育種方法很難進(jìn)行準(zhǔn)確選擇，而利用分子標(biāo)記輔助選擇育種法選育抗病品種不但準(zhǔn)確、高效、安全，而且可以在早期選擇，在抗病性育種中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)并應(yīng)用于抗病基因緊密連鎖的功能標(biāo)記大大提高了抗源篩選和抗病基因鑒定及育種選擇效率，已成為正確選擇抗病基因更有效的途徑[11]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者相繼對(duì)水稻品種的抗瘟基因型開展了研究。時(shí)克等利用基因自身的功能標(biāo)記檢測(cè)了58個(gè)水稻品種中Pi-ta、Pi-b基因的情況及其分布狀況[12]；陳濤等利用Pi-ta、Pi-b基因的功能標(biāo)記功能，對(duì)40個(gè)粳稻品種和665個(gè)粳稻新品系進(jìn)行了基因型檢測(cè)，明確了抗病基因Pi-ta、Pi-b在江蘇粳稻品種中具有一定的分布，其中Pi-b基因的分布頻率較高[13]。但在稻瘟病抗性育種中，功能標(biāo)記仍然存在著基因定位結(jié)果不精確或不準(zhǔn)確等問題，且稻瘟病病菌的致病性變異較快，一般認(rèn)為每隔5～7年，致病性便會(huì)出現(xiàn)明顯差異[14]。因此，基因聚合是培育稻瘟病持久抗性的有效方法。倪大虎等結(jié)合雜交和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，經(jīng)田間多代選育和抗性鑒定，將抗稻瘟病基因Pi9(t)和抗白葉枯病基因Xa21聚合到同一品系中，得到了2個(gè)抗性基因純合且農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的植株[15]。

本研究利用與抗病基因Pi-b、Pikh、Pi-5、Pi-d2緊密連鎖的功能標(biāo)記，對(duì)75份寧夏水稻種質(zhì)資源材料的抗性基因進(jìn)行了分子檢測(cè)，結(jié)果表明49.33%的檢測(cè)品種中含有抗稻瘟病基因Pi-b，74.67%的檢測(cè)品種含有稻瘟病抗性基因Pikh，以上2個(gè)基因在75份寧夏水稻種質(zhì)資源品種中均廣泛存在，因此這2個(gè)基因在水稻抗病性中的利用價(jià)值不大；30.67%的檢測(cè)品種含有稻瘟病抗性基因Pi-5，9.33%的檢測(cè)品種含有稻瘟病抗性基因Pi-d2，即這2個(gè)基因是水稻檢測(cè)品種中普遍缺少的，因此，Pi-d2、Pi-5基因是今后改良寧夏水稻種質(zhì)資源品種稻瘟病抗性的主要抗病基因。

表2 寧夏水稻品種抗稻瘟病基因的分子檢測(cè)結(jié)果

注：“+”表示攜帶抗病基因；“-”表示不攜帶抗病基因。