基于主成分與聚類分析的云南甘蔗細莖野生種F2代的抗旱性綜合評價

俞華先， 周清明， 安汝東， 董立華， 桃聯(lián)安， 孫有芳， 郎榮斌， 邊 芯， 田春艷， 經(jīng)艷芬

(云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所/云南瑞麗育種站，云南瑞麗 678600)

甘蔗既是我國重要的糖料作物，也是我國南方重要的經(jīng)濟作物之一。云南省是我國的第二大蔗區(qū)，蔗地地形復(fù)雜，平地少、坡地多，坡地植蔗面積占全省植蔗總面積的70%，且多為雨養(yǎng)蔗區(qū)，蔗地土壤肥瘦不一，缺少基本的灌溉設(shè)施，這導(dǎo)致抵御自然災(zāi)害的能力不足，遇上持續(xù)干旱天氣，甘蔗產(chǎn)量會受很大影響，2009—2010年極端干旱造成企業(yè)、蔗農(nóng)經(jīng)濟損失達36億元。季節(jié)性干旱是甘蔗生產(chǎn)的主要制約因素，云南省及廣西省部分地區(qū)2010年初發(fā)生的嚴重干旱，使云南省30萬hm2甘蔗面積中有20.87萬hm2受到影響，4萬hm2絕收[1]。另外，甘蔗主栽品種單一，新臺糖系列品種獨擋一面，自主選育的甘蔗品種屈指可數(shù)，這使得大陸蔗糖產(chǎn)業(yè)面臨因品種單一引起病蟲害暴發(fā)而全面絕收的危機。提升中國大陸甘蔗品種的自主創(chuàng)新能力，快速選育出抗旱性強的旱坡地甘蔗新品種十分必要。

甘蔗細莖野生種(SaccharumspontaneumL.)別稱割手密或甜根子草，是甘蔗屬及其近緣屬種，也是現(xiàn)代甘蔗栽培品種的主要抗逆基因資源[2]。甘蔗細莖野生種在云南省分布范圍最為廣泛，遺傳多樣性豐富，是育種成效最為顯著的一個野生種。利用甘蔗野生種質(zhì)資源改良甘蔗生產(chǎn)品種的抗旱性、抗逆性、宿根性、適應(yīng)性，是甘蔗育種的有效手段[3]。探討作物對水分脅迫的適應(yīng)機理及作物抗旱性遺傳改良一直是國內(nèi)外育種工作者關(guān)注的熱點，并從不同角度研究作物的抗旱性指標和鑒定方法[4-7]，有許多學者采用模糊隸屬函數(shù)法、分級評價法、相關(guān)分析法、灰色關(guān)聯(lián)度分析法、逐步判別分析法、聚類分析法等[8-15]對作物抗旱性進行綜合評價。模糊隸屬函數(shù)評價法由于沒有統(tǒng)一的抗性區(qū)間參考標準，不利于制定抗旱性分級標準，而系統(tǒng)聚類法能區(qū)分各品種的抗旱級別，恰好可以彌補模糊隸屬函數(shù)法的不足，將這2種方法結(jié)合可使綜合評定更準確、更科學。另外，結(jié)合主成分分析、隸屬函數(shù)、系統(tǒng)聚類等綜合評價甘蔗生理生化指標對干旱脅迫響應(yīng)的報道相對較少[16]。

云南瑞麗育種站自建站以來，一直致力于云南野生甘蔗細莖野生種種質(zhì)創(chuàng)新、親本培育、甘蔗品種抗逆性改良研究[17-18]，快速篩選出了一批抗旱性強的育種親本材料。本研究以云南不同氣候類型的26個甘蔗細莖野生種為材料，測定其具有代表性的形態(tài)、生理指標，運用主成分分析法[19-21]和模糊隸屬函數(shù)，并采用系統(tǒng)聚類分析結(jié)合形態(tài)指標評價不同甘蔗細莖野生種的抗旱性，為甘蔗細莖野生種抗旱育種利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為云南甘蔗細莖野生種F2代的26個種質(zhì)材料，代號及材料名稱見表1。

1.2 試驗方法

試驗在云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所瑞麗育種站內(nèi)進行，該站位于24°N、97°83′E，海拔776 m，年均降水量 1 394 mm，年均氣溫20 ℃。于2014—2015年每年2月中旬，對供試材料單芽砍種、桶栽，每桶5個單芽，分別進行干旱脅迫、正常供水處理，每處理3桶，重復(fù)3次。持續(xù)處理7 d及解除脅迫復(fù)水3 d后測定各項指標。

表1 參試材料及其代號

1.3 測定內(nèi)容和方法

1.3.1 形態(tài)指標 于試驗處理后每月第5、第10、第15天，對試驗處理的甘蔗分別統(tǒng)計綠葉數(shù)、枯黃葉數(shù)，取平均數(shù)，計算綠葉率及傷害度：綠葉率=綠葉數(shù)/(綠葉數(shù)+枯黃葉數(shù))×100%；綠葉率傷害度=(對照綠葉率-處理綠葉率)/對照綠葉率×100%。

1.3.2 生理指標 干旱脅迫前及試驗處理后第16天，參照王尊欣等的方法[22]測定土壤含水量；分別采用SPAD 502 Plus型葉綠素測定儀、雷磁DDSJ2308型電導(dǎo)儀、硫代巴比妥酸顯色法、蒽酮法測定相同部位葉片的葉綠素相對含量、質(zhì)膜透性(PMP)、丙二醛(MDA)含量、可溶性糖含量[23-25]；采用 YMJ-B型手持活體激光葉面積儀測定葉面積。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2007軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；采用DPS 15.1軟件對數(shù)據(jù)進行主成分分析及聚類分析，采用類平均法、歐氏距離進行聚類。

耐旱系數(shù)(DC)參照付風玲等方法[26]計算，公式為：

DC=干旱脅迫下指標性狀值/正常供水下指標性狀 值×100%。

模糊隸屬函數(shù)參照周廣生等的方法[27]，公式為：

Z(xj)=(x-xmin)/(xmax-xmin)。

式中：xmin、xmax分別為各參試材料中某一指標抗旱系數(shù)的最小值、最大值，x為各參試材料中某一指標的抗旱系數(shù)。指標性狀和抗旱性如呈正相關(guān)，則直接可算出其隸屬函數(shù)值Z(xj)；若呈負相關(guān)，則用1-Z(xj)表示。權(quán)重Wj[28]及綜合值D[29]計算公式分別為：

式中：Pj為各個材料中第j個綜合指標貢獻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對甘蔗細莖野生種葉片綠葉率、傷害度的影響

綠葉率反映葉片在逆境時的衰老情況[30]。甘蔗細莖野生種種質(zhì)材料在干旱脅迫過程中，其葉片逐漸枯黃卷曲，綠葉數(shù)不斷減少，光合作用的面積也大幅度減少。因此，在干旱脅迫過程中，綠葉率較高的材料相對抗旱性較強。由表2可見，云割F211-159、云割F211-208、云割F211-231的綠葉率均值相對較高、傷害度較低，為對干旱脅迫反應(yīng)鈍感類型；云割F211-97、云割F211-196、云割F211-215的綠葉率均值相對較低、傷害度較高，為對干旱反應(yīng)敏感類型；其他材料屬中間類型。

2.2 干旱脅迫對甘蔗細莖野生種土壤含水量的影響

試驗結(jié)果表明，試驗處理前土壤含水量均值為18.82%；試驗處理第16天后，正常供水(CK)的甘蔗細莖野生種土壤平均含水量為19.01%，說明其沒有受到干旱脅迫，而干旱脅迫處理的土壤含水量平均值為4.94%，比處理前下降13.88百分點，且各參試甘蔗品種葉片均處于清晨無“吐水”現(xiàn)象的萎蔫狀態(tài)，說明此時甘蔗細莖野生種已受到較為嚴重的干旱脅迫。

2.3 各參試材料抗旱相關(guān)性狀指標的測定值分析

由表3可見，除相對含水量外，干旱脅迫對參試材料各抗旱相關(guān)性狀指標有極顯著影響(P<0.01)，各種質(zhì)材料均值變異系數(shù)介于0.149～0.248之間，說明本研究選用的種質(zhì)材料類型較為豐富，考察的指標對干旱脅迫反應(yīng)較為敏感；在干旱脅迫、正常供水條件下，除相對含水量差異不顯著(P>0.05)外，其他性狀相關(guān)性差異為極顯著(P<0.01)，這進一步說明各抗旱指標對脅迫的敏感程度存在較大差異，單一性狀無法衡量其抗旱強弱。

2.4 各單項生理指標的相關(guān)性分析

植物器官衰老或在逆境條件下往往會發(fā)生膜脂過氧化作用，而丙二醛是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物之一，丙二醛含量可以反映植物遭受傷害的程度[29]。由表4可見，各抗旱性生理生化指標間存在一定的相關(guān)性，可溶性糖含量與丙二醛含量呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，表明可溶性糖含量與丙二醛含量的間接作用相對較大，試驗過程中隨著干旱脅迫程度的增加，丙二醛含量會升高，導(dǎo)致植物體內(nèi)保護酶系統(tǒng)的活力和平衡受到破壞[31]，進而使植株光合作用受到影響，合成的可溶性糖也相應(yīng)減少；可溶性糖含量與葉綠素含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，這與葉綠素含量多的植株光合作用相對較強，合成的可溶性糖含量也會相應(yīng)增多的生理反應(yīng)相吻合；相對含水量與丙二醛含量也呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，這表明干旱脅迫下，種質(zhì)材料為抵御干旱，其相對含水量與丙二醛含量均有大幅度增加。在干旱脅迫中，各單項生理指標起的作用不盡相同，如果直接采用這些指標對甘蔗細莖野生種F2代種質(zhì)材料進行抗旱性評價，則不能準確評價出各參試甘蔗種質(zhì)的抗旱性。

2.5 參試種質(zhì)抗旱性狀的主成分分析

以26個云南甘蔗細莖野生種F2代種質(zhì)材料相關(guān)性狀的耐旱系數(shù)為基礎(chǔ)，用DPS軟件對丙二醛含量、相對質(zhì)膜透性、葉綠素含量、可溶性糖含量、相對含水量這5個生理生化指標進行主成分分析[32-36]，計算各主成分的特征向量和貢獻率。由表5可知，3個主成分的累計貢獻率已達83.153 0%，而一般認為累計貢獻率達70%以上即為比較滿意[26]，因此可以用這3個主成分對其抗旱性進行綜合分析，這就將原來的5個單項指標化成3個新的綜合指標，這些綜合指標相互獨立，代表了原來指標83.153 0%的信息；在主成分1中，葉綠素含量系數(shù)相對最大、丙二醛含量(絕對值)系數(shù)略低，反映了全部信息的41.843 9%，故該成分代表了葉綠素、丙二醛含量；在主成分2中，相對質(zhì)膜透性和可溶性糖含量(絕對值)系數(shù)相對較大，反映了全部信息的25.354 3%，故該成分代表了相對質(zhì)膜透性和可溶性糖含量；在主成分3中，質(zhì)膜透性和葉綠素相對含量系數(shù)相對較大，反映了全部信息的15.954 8%，故該成分代表著質(zhì)膜透性和葉綠素含量。

表2 不同種質(zhì)材料在干旱脅迫下的綠葉率比較

注：*、**分別表示差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。表3、表4同。

表3 干旱脅迫與正常供水條件下各參試材料的抗旱相關(guān)性狀統(tǒng)計分析

表4 各單項生理指標相關(guān)系數(shù)矩陣

2.6 綜合抗旱性評價

在嚴重干旱脅迫條件下，隸屬函數(shù)值越大，說明該種質(zhì)材料在相應(yīng)綜合指標上抗旱性表現(xiàn)越強。由表6可見，3個綜合指標的權(quán)重分別為0.503、0.305、0.192；云割F211-159 的綜合值相對最大，為0.958，說明其最抗旱，云割F211-215的綜合值相對最小，僅為0.115，說明其最不抗旱，其他24個甘蔗細莖野生種種質(zhì)介于兩者之間。

2.7 聚類分析

采用類平均法(UPGMA)對26個云南甘蔗細莖野生種F2代種質(zhì)材料綜合值(D值)進行系統(tǒng)聚類，結(jié)果如圖1所示，當歐式距離等于1.00時，可將供試云南甘蔗細莖野生種F2代種質(zhì)分為4類：第Ⅰ類包含抗旱性度量值排名1～6的6個材料，其在歐式距離為0.60處又分為2個亞類，第1個亞類包含抗旱性度量值排名第1位的云割F211-159，第2亞類包含抗旱性度量值排名2～6的5個材料，分別為云割F211-23、云割F211-78、云割F211-160、云割F211-260、云割F211-156等；第Ⅱ類包含抗旱性度量值排名7～22的16個材料，在歐式距離為0.40處又分為2個亞類，第1個亞類包含抗旱性度量值排名7～15的9個材料，其中有云割F211-52、云割F211-84、云割F211-141、云割F211-199等材料，第2亞類包含抗旱性度量值排名16～22的7個材料，其中有云割F211-133、云割F211-46、云割F211-68、云割F211-161、云割F211-149等；第Ⅲ類包含抗旱性度量值排名23～25的3個材料，分別為云割F211-182、云割F211-97、云割F211-196；第Ⅳ類包含1個材料，為云割F211-215，是抗旱性相對最差的種質(zhì)材料。

表5 主成分的特征向量及貢獻率

表6 各試驗材料的綜合值I(xj)、隸屬函數(shù)值Z(xj)、權(quán)重、綜合值

3 結(jié)論與討論

作物抗旱性受多種因素影響，采用隸屬函數(shù)法綜合評價小麥抗旱性一定的局限性[37-39]，而以多指標評價又過于繁瑣和低效，且指標間存在一定的相關(guān)性，即指標所提供的種質(zhì)材料對干旱脅迫相應(yīng)的信息發(fā)生交叉和重疊，且各指標在評價時因其本身之間權(quán)重差異，會直接導(dǎo)致評價結(jié)果發(fā)生偏差。因此，通過其中幾個主要的因素進行分析則可達到快速、準確的目的[40-41]。本研究運用主成分分析法，將5個單項生理生化指標轉(zhuǎn)化為3個綜合指標，并根據(jù)其綜合指標值貢獻率求出其相應(yīng)的隸屬函數(shù)值，依據(jù)各綜合指標的相對重要性進行加權(quán)，得到各品種抗旱性的綜合評價值[33]。由于綜合評價值是一個無量綱的數(shù)，從而使各品種的抗旱性差異具有可比性[41]。

本研究結(jié)果表明，在形態(tài)指標上，云割F211-159的綠葉率均值相對較高、傷害度較低，屬對干旱脅迫反應(yīng)鈍感的類型；云割F211-46、云割F211-215的綠葉率均值相對較低、傷害度較高，屬對干旱反應(yīng)敏感的類型，而其他材料屬于中間類型；從生理生化指標看，水分脅迫使植株體內(nèi)相對含水量、質(zhì)膜透性、丙二醛含量[23]有大幅度的增加，葉綠素含量減少，且不同種質(zhì)材料增幅差異較大，這說明種質(zhì)材料的抗旱性是通過多個指標來實現(xiàn)的，且是由多個因素來控制的；通過主成分分析、結(jié)合隸屬函數(shù)法和系統(tǒng)聚類分析看，由5個單項生理生化指標綜合成的3個獨立指標代表了全部原始數(shù)據(jù) 83.153 0% 的信息量，26個云南甘蔗細莖野生種F2代種質(zhì)材料可分為4類：第Ⅰ類是包含抗旱性度量值排名1～6的6個材料，主要有云割F211-159、云割F211-23、云割F211-78 等抗旱性較好的種質(zhì)材料；第Ⅱ類包含抗旱性度量值排名7～22的16個材料，主要有云割F211-52、云割F211-84、云割F211-141等材料，其抗旱性良好；第Ⅲ類包含抗旱性度量值排名23～25的3個材料，分別為云割F211-182、云割F211-97、云割F211-196，表現(xiàn)為抗旱性中等；第Ⅳ類是抗旱較差的種質(zhì)材料，為云割F211-215。

總之，評價植物抗旱性是一個復(fù)雜的綜合性狀，而用單一指標評價云南甘蔗細莖野生種F2代種質(zhì)材料的抗旱能力具有一定的片面性，本研究選用的形態(tài)指標和生理生化指標也具有一定的局限性，還須結(jié)合生產(chǎn)實際作進一步的檢驗。