花椒油主要活性物質對荔枝霜疫霉的抑菌活性

曾令達， 黃仲景， 廖建良， 尹 艷， 宋冠華， 鄭 倩

(惠州學院生命科學學院，廣東惠州 516007)

荔枝霜疫霉病是荔枝生產和果實貯藏中最主要的一種病害，會給產量和果品貯藏帶來極大的損失[1-2]，其病原為荔枝霜疫霉[3]。南方夏季荔枝果實發育期及采收期正值高溫多雨季節，荔枝果實極易受荔枝霜疫霉的侵染，造成果實腐爛變質。荔枝霜疫霉病在果園管理中仍以安克錳鋅、瑞毒霉錳鋅等化學藥劑防治為主[4-5]，在荔枝生產中使用化學藥劑容易造成荔枝霜疫霉抗藥性提高，頻繁用藥又易造成環境污染和農藥殘留，存在安全隱患。因此，研究和開發植物活性物質防治荔枝霜疫霉病對環境和果品安全，對促進荔枝產業發展具有重要意義。目前，已研究發現一些植物的提取物對荔枝霜疫霉具有較強的抑制活性[6]。宋冠華等發現，白鮮、虎杖、蛇床等植物的乙醇提取物對荔枝霜疫霉有較強的抑制效果[7]。吳光旭等發現，開口箭中的1β，2β，3β，4β，5β，7α-六羥基螺甾-25(27)-烯-6-酮和螺甾-25(27)-烯-1β，2β，3β，4β，5β，6β，7α-七醇具有抗荔枝霜疫霉菌活性[8]。胡珊等研究發現，丁香酚、香芹酚、檸檬醛、肉桂醛等均對荔枝霜疫霉有抑制作用[9]。曾令達等發現，苦參提取物對荔枝霜疫霉具有較強的抑制作用[10]，但目前關于花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)油中的檸檬烯、桉樹腦、月桂烯等3種主要活性物質對荔枝霜疫霉的抑菌效果和差異的研究未見報道。因此，本試驗在離體培養條件下，運用菌絲生長法測定3種物質的抑菌活性，進一步探索植物提取物具有抑菌活性的原因，同時研究不同抑菌活性物質的抑菌能力差異，以及活性物質復配對荔枝霜疫霉的抑制作用，以期為探尋新型的植物源抑菌活性物質用于荔枝霜疫霉病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

供試菌種為荔枝霜疫霉菌(PeronophythoralitchiChen.)，由惠州學院生命科學學院植物學實驗室提供。供試檸檬烯(純度≥97%)、桉樹腦(純度≥99%)、月桂烯(純度≥90%)、苦參堿(純度≥98%)等，均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。吐溫-80(分析純)，購自天津市大茂化學試劑廠。

1.2 抑菌活性測定

1.2.1 單一活性物質的抑菌活性測定 在培養皿中倒入經高溫高壓滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，簡稱PDA)培養基[200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15～20 g瓊脂，1 000 mL 自來水，pH值自然]，制成平板后接種荔枝霜疫霉菌。于28 ℃培養7 d后荔枝霜疫霉菌菌種培養完成，用無菌打孔器沿著菌種菌落邊緣打取直徑為4 mm的菌餅。將檸檬烯和桉樹腦純品預先稀釋成濃度為0.20 mg/mL的母液(加入適量的吐溫-80作為分散劑)，將月桂烯純品制成濃度為 25.00 mg/mL 的母液，經細菌過濾器過濾膜過濾后攝取適量的母液與已滅菌尚未凝固的PDA培養基混合，得到一定濃度含活性物質的培養基。培養基凝固后，用已滅菌的鑷子將菌餅移接到含藥培養基中央，將培養皿倒置，在28 ℃條件下進行恒溫培養，7 d后用十字交叉法測量并記錄菌落直徑，同時以只添加吐溫-80的培養基作為空白對照，每個處理重復5次。

抑菌率計算公式：抑菌率=(對照菌落凈生長量-處理菌落凈生長量)/對照菌落凈生長量×100%。按抑菌率大小查生物統計概率值換算表，將抑菌率換算成相應的概率值，質量濃度用其對數值表示，以各抑菌劑濃度的對數值(X)和抑菌率的概率值(Y)求毒力回歸方程Y=a+bX，并計算抑菌中濃度(EC50)。

1.2.2 活性物質復配物的抑菌活性測定及其增效比的計算 將檸檬烯和苦參堿預先稀釋成濃度為0.1 mg/mL的母液(加入適量吐溫-80作為分散劑)，攝取適量苦參堿、檸檬烯母液按1 ∶1(體積比)配制一定濃度的含活性物質的培養基。接種培養、菌落測定及EC50的計算同“1.2.1”節。

參照農藥組合物協同增效作用判斷方法[11]計算增效比。活性物質復配物的理論EC50計算公式為復配物理論EC50=(a+b)/[(a/A的EC50)+(b/B的EC50)]，式中，A、B分別代表不同植物提取物，a、b分別為2種提取物在混劑中含量的占比。以增效比(synergic ratio，簡稱SR)判定不同混合組配的抑菌物質的抑菌作用是否具有增效作用，SR<0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR>1.5為增效作用。SR計算公式為SR=EC50理論值/EC50實測值。

1.3 統計分析

試驗數據采用Excel 2007、SPSS 19.0進行統計的分析。

2 結果與分析

2.1 檸檬烯對荔枝霜疫霉菌的抑制活性

由表1可知，檸檬烯對荔枝霜疫霉菌的抑制率隨著檸檬烯濃度的增加而變大。當檸檬烯濃度為2.0 mg/L時，抑菌率為11.5%，當檸檬烯濃度為16.0 mg/L時，抑菌率為89.8%，當檸檬烯濃度達到32.0 mg/L時，抑菌率達到100.0%，說明此時檸檬烯對荔枝霜疫霉菌菌絲生長具有完全的抑制作用。根據抑菌率和檸檬烯的濃度計算出檸檬烯的毒力方程為Y=3.680 8X+2.385 1，r2=0.911，從毒力方程得出檸檬烯對荔枝霜疫霉菌的EC50為7.2 mg/L。

2.2 桉樹腦對荔枝霜疫霉菌的抑制活性

由表2可知，當桉樹腦濃度為2.5 mg/L時，抑菌率為20.5%，而當桉樹腦濃度為20.0 mg/L時，抑菌率達到了 86.7%，當桉樹腦濃度為40.0 mg/L時，抑菌率為100.0%。隨著桉樹腦濃度的增加，對荔枝霜疫霉菌的抑制作用隨之增大，當桉樹腦濃度為40.0 mg/L時，對荔枝霜疫霉菌的生長具有完全的抑制用。根據抑菌率和桉樹腦的濃度計算出桉樹腦的毒力方程為Y=3.530 8X+2.118 1，r2=0.993，從毒力方程得出桉樹腦對荔枝霜疫霉菌的EC50為6.5 mg/L。

表1 不同濃度檸檬烯對荔枝霜疫霉菌的抑制效果

表2 不同濃度桉樹腦對荔枝霜疫霉菌的抑制效果

2.3 月桂烯對荔枝霜疫霉菌的抑制活性

由表3可知，當月桂烯的濃度為25.0 mg/L時，對荔枝霜疫霉的抑菌率為17.3%，當月桂烯的濃度為50.0 mg/L時，抑菌率為25.5%，說明月桂烯對荔枝霜疫霉菌有抑菌活性，但月桂烯的濃度增加了1倍，抑菌率才增加8.2%，說明月桂烯的抑菌效果較低。在月桂烯的處理濃度較大時，抑菌率有所增加，當月桂烯的濃度為200.0 mg/L時，抑菌率為 74.3%，而當月桂烯的濃度為400.0 mg/L時，抑菌率僅為88.2%。從月桂烯的不同處理來看，月桂烯對荔枝霜疫霉菌的抑菌率隨著處理濃度的增加而加大，說明月桂烯對荔枝霜疫霉菌具有抑菌活性，但在較高處理濃度時，抑菌率未達100%。根據抑菌率和月桂烯的濃度可以計算出月桂烯的毒力方程為Y=1.727 6X+1.566 1，r2=0.976，從毒力方程得出月桂烯對荔枝霜疫霉菌的EC50為97.2 mg/L。

表3 不同濃度月桂烯對荔枝霜疫霉菌的抑制效果

2.4 苦參堿+檸檬烯復配劑對荔枝霜疫霉菌的抑制活性

由表4可知，當復配物濃度為2.0 mg/L時，抑菌率為 8.7%，當復配劑的濃度提高時，抑菌率增加，當復配物濃度為32.0 mg/L時，抑菌率達到95.7%。將復配劑的濃度和抑菌率進行回歸分析，得到復配劑的毒力回歸方程為Y=2.597 6X+2.540 1，r2=0.953，EC50實測值為8.9 mg/L。通過計算復配劑的EC50理論值為16.4 mg/L，增效比為1.8，苦參堿與檸檬烯的復配作用表現為增效作用。

表4 苦參堿+檸檬烯復配劑對荔枝霜疫霉菌的抑制效果

注：苦參堿對荔枝霜疫霉菌的EC50為105.0 mg/L，數據暫未發表。

3 討論與結論

花椒是一種重要的食用調味品、中藥材、香料及木本油料樹種，屬蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylum)[12]。張懷予等分析發現，花椒油中成分共有73種化學物質，以萜烯、醇、酯類物質為主，檸檬烯、桉樹腦、月桂烯的含量分別為 20.204%、5.049%、4.937%，這3種物質為花椒油的主要成分[13]。袁娟麗等發現，花椒揮發油主要化合物成份鑒定出的物質中有5種物質的相對含量超過60%，其中桉樹腦占 15.64%、D-檸檬油精占13.72%、β-月桂烯占10.20%[14]。不同產地的花椒油成分不太一樣，花椒果皮揮發油相對含量在3%以上，成分各有不同，但主要以單菇類物質為主，但共有的成分有檸檬烯、月桂烯、按樹腦等[15]。花椒油對真菌有抑制作用，是天然的抑菌植物源物質[16]。唐裕芳等發現，花椒油含有的桉樹油、其酯類、β-月桂烯、檸檬烯等成分有協同作用，具有一定的抑菌能力[17]。花椒油乙醇提取物對荔枝霜疫霉菌具有較好的抑制作用[10]。高紅亮等發現，檸檬烯在橙汁保鮮中具有較好的保鮮效果[18]。檸檬烯是安全無毒、應用廣泛的防腐劑，且具有廣譜的抗菌性[19]。孟雪等發現，桉樹腦對5種真菌具有一定的抑制作用[20]。郭阿君發現，月桂烯對枯草芽孢桿菌有抑制作用[21]。本試驗中檸檬烯、桉樹腦、月桂烯等3種物質對荔枝霜疫霉菌均表現出抑制作用，3種活性物質中桉樹腦對荔枝霜疫霉菌的EC50最低，為 6.5 mg/L，其次為檸檬烯，為7.2 mg/L，月桂烯的最高，為 97.2 mg/L。

苦參堿屬于四環喹嗪啶類化合物，是苦參、苦豆子、廣豆根等豆科中草藥的活性物質，分子式為C15H24N2O，相對分子質量為266[22-24]。苦參堿對多種真菌具有抑菌活性[25-26]。曾令達等用乙醇提取花椒和苦參的抑菌活性物質，發現苦參和花椒的粗提物按1 ∶1(體積比)復配對抑制荔枝霜疫霉菌具有增效作用[27]。本試驗中以花椒中的活性物質檸檬烯與苦參堿按1 ∶1(體積比)進行復配，在對荔枝霜疫霉菌的抑制試驗中增效比為1.8，兩者復配具有增效作用。因此，從本試驗的結果來看，可以從花椒中提取活性物質用于荔枝霜疫霉病的防治，為增加抑菌效果，可以選擇與其他植物的活性物質進行復配。