大葉蒲公英耐鹽突變體的篩選與植株再生

劉艷芬， 王秀萍， 陳翠果， 梁偉玲， 王婷婷

(1.河北工程大學(xué)園林與生態(tài)學(xué)院，河北邯鄲 056021； 2.唐山市植物耐鹽研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所，河北唐山 063200)

鹽害是影響作物產(chǎn)量的一種主要的非生物逆境危害，土壤的鹽漬化已成為限制我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素。如何開(kāi)發(fā)利用鹽堿地，以增加有效可耕地面積、提高作物產(chǎn)量，已成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)學(xué)科研究的重要任務(wù)之一。目前，培育耐鹽作物品種、提高作物耐鹽性，已成為開(kāi)發(fā)利用鹽堿地、提高經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量最根本和最有效的方法[1]。已有研究表明，在鹽漬化土壤和海水或咸水脅迫下生長(zhǎng)的植物，能夠更多地積累營(yíng)養(yǎng)元素和活性物質(zhì)，具有更好的營(yíng)養(yǎng)、藥用和其他經(jīng)濟(jì)品質(zhì)，這使得通過(guò)各種途徑篩選培育多樣化的耐鹽經(jīng)濟(jì)植物更具有必要性[2]。

通過(guò)組織培養(yǎng)獲得愈傷組織的耐鹽突變體，進(jìn)而培育出耐鹽的品種或品系，是蒲公英生物技術(shù)抗性育種的研究方向之一。蒲公英(Taraxacummongolicum)是對(duì)菊科蒲公英屬植物的通稱，種類繁多。一些生長(zhǎng)在鹽漬環(huán)境中的蒲公英種類生物量小，難以在鹽堿地區(qū)獲得高產(chǎn)[2]。大葉蒲公英是野生蒲公英的四倍體變異體，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、醫(yī)療價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值都較高，而且生物量大，是有待推廣的新品種，但其耐鹽性卻較弱。本研究以大葉蒲公英葉片為外植體，通過(guò)鹽脅迫處理，從愈傷組織中誘導(dǎo)產(chǎn)生耐鹽突變體，進(jìn)而誘導(dǎo)突變的愈傷組織再生成完整植株，旨在為蒲公英的耐鹽育種和快速高效的離體再生體系提供依據(jù)，也為更好地開(kāi)發(fā)和利用蒲公英奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為大葉蒲公英葉片。將大葉蒲公英種子盆栽播種，剪取生長(zhǎng)20～30 d的幼葉作外植體誘導(dǎo)愈傷組織，篩選耐鹽突變體后，誘導(dǎo)形成不定芽與不定根，獲得再生植株。

1.2 方法

1.2.1 大葉蒲公英愈傷組織耐鹽突變體的獲得

1.2.1.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 將大葉蒲公英葉片剪成1 cm2左右的小塊，常規(guī)消毒后，將外植體分別接種到不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種45 d后統(tǒng)計(jì)各處理愈傷組織的發(fā)生率和生長(zhǎng)狀況。誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)5個(gè)處理：處理1，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；處理2，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；處理3，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA；處理4，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.04 mg/L 2，4-D；處理5，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.06 mg/L 2，4-D。

1.2.1.2 耐鹽愈傷組織突變體的篩選與鑒定 將繼代5次的愈傷組織切成0.5 cm×0.5 cm左右的小塊，分別接種于附加NaCl含量為0%、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%的繼代培養(yǎng)基上，進(jìn)行鹽脅迫處理，從中選出愈傷組織耐鹽突變體，轉(zhuǎn)入無(wú)鹽和耐鹽培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)2次，再將其轉(zhuǎn)到無(wú)鹽繼代培養(yǎng)基上擴(kuò)增培養(yǎng)2個(gè)月。將篩選出的突變愈傷組織與對(duì)照進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)檢測(cè)。

1.2.2 蒲公英耐鹽突變體的植株再生

1.2.2.1 耐鹽突變體不定芽的誘導(dǎo) 將多次繼代的耐鹽愈傷組織突變體轉(zhuǎn)接到不同的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，根據(jù)不定芽發(fā)生狀況，篩選出適合的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。處理1：MS+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；處理2：MS+0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；處理3：MS+0.3 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；處理4：MS+0.1 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA；處理5：MS+0.2 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA；處理6：MS+0.3 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA。

1.2.2.2 耐鹽突變體不定根的誘導(dǎo) 將耐鹽突變體的不定芽叢經(jīng)過(guò)多次繼代，獲得較多數(shù)量的不定芽，此時(shí)不定芽嫩弱，不利于生根。轉(zhuǎn)入不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的壯苗培養(yǎng)基繼代 1～2次。之后將不定芽剪切成最小芽叢，轉(zhuǎn)接到含有不同生長(zhǎng)素的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)。誘導(dǎo)20 d后，根據(jù)不定根的發(fā)生狀況，選出適合的生根培養(yǎng)基配方。對(duì)照：1/2MS(不含生長(zhǎng)條件物質(zhì))；處理1：1/2MS+0.1 mg/L IBA；處理2：1/2MS+0.3 mg/L IBA；處理3：1/2MS+0.1 mg/L NAA；處理4：1/2MS+0.3 mg/L NAA。在整個(gè)組織培養(yǎng)過(guò)程中，如無(wú)特殊情況說(shuō)明，培養(yǎng)條件如下：溫度(23±2) ℃，每天光照16 h，光照度 2 500 lx。培養(yǎng)基中含瓊脂5.5 g/L，蔗糖30 g/L，pH值5.8。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉蒲公英愈傷組織耐鹽突變體的獲得

2.1.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的確定 在不含2，4-D的培養(yǎng)基中，愈傷組織發(fā)生率較低，面積小，質(zhì)地緊湊。隨著 2，4-D 濃度的增加，愈傷組織的發(fā)生率逐漸提高，且愈傷組織面積逐漸變大。但是在處理5中的愈傷組織質(zhì)地變得疏松，不利于繼代培養(yǎng)，這可能與2，4-D濃度過(guò)高有關(guān)(表1)。因此，選擇處理4，即MS+0.5 mg/L 6-BA+0.04 mg/L 2，4-D 作為愈傷組織誘導(dǎo)的合適培養(yǎng)基(圖1)。從愈傷組織分布來(lái)看，葉片切塊的部位不同，愈傷組織的發(fā)生量有所不同，含葉脈的比不含葉脈的切塊產(chǎn)生的愈傷組織面積大，形成速度快。因此，盡量切取葉脈附近的葉片作為外植體，以獲得更多的愈傷組織。

表1 大葉蒲公英葉片外植體在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上愈傷組織發(fā)生情況

2.1.2 愈傷組織耐鹽突變體的獲得 將初代培養(yǎng)的蒲公英愈傷組織在原誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代多次后，愈傷組織變得松散，于是將其繼代于降低了2，4-D濃度的培養(yǎng)基上，根據(jù)愈傷組織生長(zhǎng)狀況和增殖率，確定了培養(yǎng)基配方為MS+0.4 mg/L 6-BA+0.02 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA。在此繼代培養(yǎng)基上，愈傷組織的生長(zhǎng)速度快，質(zhì)地結(jié)構(gòu)適中。

愈傷組織接種在上述繼代培養(yǎng)基上，分別附加NaCl含量為0%、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%、2.0%進(jìn)行鹽脅迫培養(yǎng)。1周后愈傷組織開(kāi)始變褐，2周至3周后逐漸死亡，4周后絕大部分愈傷組織變褐死亡，但在個(gè)別的愈傷組織內(nèi)部，發(fā)現(xiàn)有黃綠色的愈傷組織存活(圖2)。NaCl含量為 2.0% 的愈傷組織全部死亡。將存活愈傷組織接種到含有相應(yīng)NaCl濃度的培養(yǎng)基上繼續(xù)耐鹽培養(yǎng)，每3周繼代1次，耐鹽繼代4次后，轉(zhuǎn)入含0%和2%NaCl培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)2次。之后在無(wú)鹽培養(yǎng)基上增殖，獲得了更多的耐鹽愈傷組織。

將對(duì)照與NaCl含量分別為0%、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%(代號(hào)分別為CK、y0、y1、y2、y3、y4、y5、y6)的耐鹽愈傷組織進(jìn)行RAPD檢測(cè)，確定突變體。共采用15條隨機(jī)引物對(duì)耐鹽突變體和對(duì)照進(jìn)行RAPD分析，隨機(jī)引物分別是S36、S224、S262、S267、S308、S358、OPA-19、OPC-05、OPD-05、OPG-06、SJ14、OPC-11、OPB-12、S90、S309。由圖3可以看出，S358引物對(duì)6號(hào)(1.2% NaCl)、OPA-19引物對(duì)5號(hào)(1.0% NaCl)、OPC-05引物對(duì)4號(hào)(0.8% NaCl)愈傷組織均擴(kuò)增出了與對(duì)照不同的差異條帶。因此可見(jiàn)，NaCl含量為0.8%、1.0%、1.2%的培養(yǎng)基上存活下來(lái)的愈傷組織遺傳物質(zhì)均發(fā)生了變異，本次鹽脅迫獲得的蒲公英耐鹽愈傷組織為耐鹽突變體。

2.2 蒲公英耐鹽突變體的植株再生

2.2.1 耐鹽愈傷組織不定芽的誘導(dǎo) 研究發(fā)現(xiàn)，不同種類和濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對(duì)于愈傷組織不定芽的發(fā)生有重要影響(表2)。愈傷組織在較高濃度6-BA(處理3、處理6)的培養(yǎng)基上，不定芽發(fā)生數(shù)量較多，但葉片較細(xì)小，甚至有玻璃化發(fā)生。在較低濃度6-BA(處理1、處理4)培養(yǎng)基上，不定芽發(fā)生數(shù)量較少。處理3、處理6、處理2的不定芽增殖率與其他處理有顯著差異，三者之間差異不顯著，但處理2，即培養(yǎng)基配方為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA的不定芽生長(zhǎng)健壯，有利于不定芽的繼續(xù)增殖和生根培養(yǎng)，選擇此培養(yǎng)基作為耐鹽愈傷組織生成不定芽的最適培養(yǎng)基(圖4)。

表2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物組合的培養(yǎng)基上不定芽生長(zhǎng)狀況

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。增殖率=繼代后的不定芽總數(shù)/原不定芽數(shù)。

2.2.2 耐鹽愈傷組織不定根的誘導(dǎo) 研究發(fā)現(xiàn)，可將增殖的不定芽在生根之前先轉(zhuǎn)入無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上壯苗(圖5)。生根誘導(dǎo)20 d后，在不含生長(zhǎng)素的對(duì)照培養(yǎng)基中，也有不定根發(fā)生，但是生根率低，根系生長(zhǎng)慢(表3)。隨著NAA濃度的提高，生根率明顯提高，但是NAA濃度為0.3 mg/L與 0.5 mg/L 的生根率較為接近，雖然前者不定根均長(zhǎng)略短，但平均根數(shù)較多，利于移栽成活。單獨(dú)添加IBA的生根效果沒(méi)有單獨(dú)添加NAA的效果好。因此，選擇處理3，即配方為 1/2MS+0.3 mg/L NAA作為蒲公英耐鹽愈傷組織的最適生根培養(yǎng)基(圖6、圖7)。

表3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合培養(yǎng)基上的不定芽生根狀況

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

為獲得大葉蒲公英耐鹽突變體再生植株，本試驗(yàn)以其葉片為外植體，將誘導(dǎo)出的愈傷組織經(jīng)過(guò)不同濃度耐鹽脅迫處理，經(jīng)過(guò)篩選與RAPD檢測(cè)，確定獲得了相應(yīng)鹽濃度(NaCl含量分別為0.8%、1.0%、1.2%)的耐鹽愈傷組織突變體。再通過(guò)分別誘導(dǎo)突變愈傷組織形成不定芽和不定根，獲得耐鹽突變體的再生植株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大葉蒲公英愈傷組織最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.04 mg/L 2，4-D，耐鹽突變體不定芽發(fā)生的最適培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.3 mg/L NAA。

3.2 討論

獲得耐鹽愈傷組織的方法一般有2種，一是將外植體直接接種到含鹽培養(yǎng)基上誘導(dǎo)耐鹽愈傷組織[3]；二是將普通的愈傷組織轉(zhuǎn)移到鹽濃度恒定[4-5]或逐次遞增[6-8]的培養(yǎng)基上，通過(guò)多次繼代，選出穩(wěn)定生長(zhǎng)的愈傷組織。將愈傷組織直接置于含有高于選擇濃度NaCl的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，雖然可減少形成生理適應(yīng)細(xì)胞，但有可能淘汰某些本來(lái)可能存在的變異。張新果等將蒲公英愈傷組織直接繼代到含有1.5%NaCl的培養(yǎng)基上，獲得了12株耐1.5% NaCl的蒲公英再生植株，但對(duì)其有性后代的耐鹽性未作進(jìn)一步研究[5]。本試驗(yàn)將蒲公英葉片愈傷組織接種在鹽濃度遞增的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，篩選出了耐鹽的愈傷組織突變體。雖然這種方法容易產(chǎn)生生理適應(yīng)的細(xì)胞或組織，但是本試驗(yàn)結(jié)果表明，可以獲得不同濃度級(jí)別的蒲公英耐鹽愈傷組織變異系。

利用組織和細(xì)胞培養(yǎng)篩選耐鹽性突變體植株，雖然在我國(guó)已取得了較大進(jìn)展，但仍存在一些問(wèn)題需要解決[9-10]。如部分植物的愈傷組織或細(xì)胞系的耐鹽性和再生植株的耐鹽性表現(xiàn)并非完全一致、耐鹽系難以分化成再生植株、耐鹽突變體植株農(nóng)藝性狀的改變等。目前，筆者將不同耐鹽級(jí)別的愈傷組織突變體再生出完整植株移栽入大田，并已開(kāi)花結(jié)實(shí)。下一步將進(jìn)行田間的耐鹽性鑒定，直接鑒定耐鹽變異體的耐鹽程度和變異穩(wěn)定性。