連作辣椒根圍化學成分鑒定與動態分析

袁 圓， 張愛民， 王永平， 梁傳靜， 廖芳芳， 吳康云， 張 明， 邢 丹

(1.貴州省農業科學院辣椒研究所，貴州貴陽 550006； 2.中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽 550002)

辣椒是貴州地區重要的經濟作物之一。遵義市地處貴州省北部，處于云貴高原向湖南丘陵和四川盆地過渡的斜坡地帶，地形起伏大，地貌類型復雜，海拔高度一般在800～1 300 m，屬亞熱帶季風氣候，終年溫涼濕潤，冬無嚴寒、夏無酷暑，雨量充沛，日照充足，全境可以種植辣椒，是全國聞名的辣椒主要種植區，擁有全國最大的辣椒集散交易中心，辣椒品質在全國名列前茅。近年來在當地政府的扶持下，辣椒規模逐年增加，至2016年種植規模為13萬多hm2，占全省辣椒種植總面積的48%，主要種植品種有圓顆粒、小米椒、子彈頭、二荊條等[1]。

辣椒在連年栽培的過程中受連作障礙的嚴重威脅，其產量及品質降低。化感物質的累積是產生辣椒連作障礙的主要因素之一，也是辣椒集約化發展的一個瓶頸，研究發現，在連作栽培中辣椒根系會分泌一些化感物質，譬如酚酸類物質，這些酚酸物質會隨著連作時間的增加在土壤中不斷富集，進而抑制辣椒植株生長。此外，上茬作物收獲后，其殘留植物體的分解也會釋放部分酚酸物質，不利于辣椒植株的生長。酚酸物質的累積可為土壤中病原微生物提供碳源，降低土壤pH值，影響植株對養分和水分的攝取，進而導致植株抵抗力下降，為病原菌的侵入創造有利條件，從而引起土傳病害的大暴發，危害辣椒的產量以及品質。研究表明，植物所釋放的化感物質可歸為以下幾類：水溶性有機酸類、不飽和內酯、脂肪酸和多炔、醌類物質、酚類、苯甲酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、香豆素類；類黃酮、單寧、類萜和甾類化合物、氨基酸和多肽、生物堿和氰醇、硫化物和芥子油苷、嘌呤和核苷等[2]。目前有關遵義市連作辣椒根際周圍化學成分鑒定與動態變化研究的相關報道較少，本研究通過分析不同辣椒品種、生育期及種植年限的根系及土壤化學成分，結合已被廣泛報道具有化感作用的組分，剖析遵義市辣椒主產區辣椒根系與根際土壤主要化學成分及潛在的化感物質種類及積累情況，旨在為深入研究辣椒化感物質與自毒作用提供參考，為更好更快地解決辣椒連作障礙提供基礎理論數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 選擇黔椒5號(線椒)、辣研2號(朝天椒)、綏陽小米辣(本地品種)3個品種作為供試材料，其中黔椒5號和辣研2號分別為貴州省農業科學院園藝研究所和貴州省農業科學院蠶業辣椒研究所選育的雜交品種，綏陽小米辣為當地自留種。

1.1.2 供試儀器 HP6890/5975C 氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)(美國安捷倫科技公司)、EYELA N—1100旋轉蒸發儀(東京理化器械株式會社)、SHB-Ⅲ 循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)、KQ300DE型數控超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 田間小區設計 將3個辣椒品種[黔椒5號(線椒)、辣研2號(朝天椒)、綏陽小米辣(本地品種)]分別種植在面積為667 m2的連作地(連續種植辣椒10年)和非連作地(第1年種植辣椒)里，其中每塊地均分為3個小區，每個小區按隨機區組對3個辣椒品種進行排列種植，每個品種種植60株，生長期內采用相同的栽培措施及管理模式。

1.2.2 樣品采集 于2016年7—8月(辣椒盛花期和盛果期)采集遵義市永樂鎮辣椒連作地及非連作地辣椒根系及根際土壤，按照五點取樣法，分別選擇黔椒5號(線椒)、辣研2號(朝天椒)、綏陽小米辣(本地品種)3個品種進行采樣，并帶回實驗室進行GC-MS化學成分鑒定與分析。

1.2.3 樣品前處理 將土樣和根系樣品放置在陰涼通風處自然風干，然后將土樣研磨后過40目篩備用，根系樣品粉碎后備用。分別稱取4 g土壤樣品和1 g根部樣品，加入20 mL提取液(甲醇 ∶乙酸乙酯=1 ∶1)浸提，于超聲清洗機超聲2次(每次30 min)后放置過夜。將浸提液于3 000 r/min轉速下離心5 min，將樣品溶劑部分于35 ℃減壓濃縮，土壤樣品加200 μL甲醇溶解，根系樣品加2 mL甲醇溶解，于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.4 樣品檢測 采用氣相色譜-質譜聯用儀鑒定樣品化學成分，進樣量為2 μL。

檢測條件：色譜柱為AB-INOWAX(30 m×0.25 μm×0.25 mm)毛細管柱。程序升溫：初始溫度40 ℃(保持 2 min)，以5 ℃/min升溫至240 ℃后，保持16 min。運行時間：58 min，汽化室溫度為250 ℃，載氣為高純He(99.999%)，柱前壓為7.65 psi，載氣流量為1.0 mL/min，不分流。溶劑延遲時間：5.0 min。

質譜條件：離子源為電子轟擊離子源(EI)，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，電子能量為70 eV，發射電流為34.6 μA，倍增器電壓為 1 812 V，接口溫度為280 ℃，質量范圍為29～500 amu。

化學成分鑒定：對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對Nist2005和Wiley275標準質譜圖，檢索出相應的物質，確定化學成分，并通過峰面積歸一化法測定各化學成分的相對質量分數，從而得到不同物質及組分在根際及土壤中的百分數。

1.3 數據處理

通過Excel 2007進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 辣椒根際土壤化學成分鑒定與分析

由表1可知，7月辣椒盛花期根際土壤浸提液共檢測出14類46種物質，其中烷類2種、酯類6種、酸類1種、酚類1種、醇類16種、酮類4種、醛類7種、酰胺類3種、其他類6種。所檢測出物質的相對質量分數在不同處理中存在一定的差異，其中綏陽小米辣連作地土壤中的醇類物質相對質量分數總和高達54.85%，明顯高于其非連作地及黔椒5號、辣研2號2個品種連作地和非連作地土壤中的含量；在同一辣椒品種中，醛類物質總的相對質量分數整體呈現出非連作地比連作地高的趨勢，其中香草醛是已被報道的化感物質[3-5]，在連作條件下檢測出綏陽小米辣根際土壤所占的相對質量分數為 0.67%，在非連作地沒有被檢出；酸類物質中棕櫚酸在綏陽小米辣非連作地的相對質量分數為9.76%，在其余5個處理中沒有被檢出。棕櫚酸甲酯[6-12]、γ-丁內酯[13]、苯甲醛[14-15]、苯并噻唑[16-17]已在煙草等作物上報道具有化感作用，本研究在辣椒土壤也有檢出，但是含量較少。

由表2可知，8月辣椒盛果期土壤浸提液共檢測出14類56種物質，比7月盛花期多10種物質，其中酸類物質檢測出有9種，比7月多8種；醛類檢測出9種，比7月盛花期增加2種物質，并檢出酯類7種、酚類1種、醇類16種、酮類4種、酰胺類3種、其他類7種，可以看出，醇類、醛類、酸類數量較多，酮類、酯類次之。在綏陽小米辣連作地中，酸類物質的總相對質量分數為45.78%，十七(烷)酸、十八(烷)酸/硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸/十八烯酸、亞油酸、棕櫚酸[6-12]等物質都被證實具有化感作用，其中棕櫚酸相對質量分數最高，為 28.43%；相比連作地，綏陽小米辣非連作地均未檢出相應物質。雜交品種黔椒5號(線椒)在連作地及非連作地土壤中未檢測出酸類物質，雜交品種辣研2號(朝天椒)僅在非連作地土壤里檢測出棕櫚酸。醛類物質相比7月共同含有的物質有對羥基苯甲醛、二甲基縮醛、4-甲基苯甲醛、苯甲醛、糠醛。由表2可知，辣椒盛果期沒有烷類物質被檢出，醛類物質在綏陽小米辣中，非連作地的總相對質量分數明顯比連作地高，在黔椒5號、辣研2號中卻是相反。

2.2 辣椒根系化學成分鑒定與分析

由表3可知，盛花期根系浸提液共檢測出13類77種物質，其中酸類21種、酯類9種、酚類5種、醇類16種、酮類7種、醛類8種、酰胺類4種、其他類6種，酸類物質數量占到總檢測數目的27.27%，醇類次之，占20.78%，酚、酸類共占 33.77%。根系浸出液中總相對質量分數最高的為酸類，綏陽小米辣、黔椒5號、辣研2號非連作地和連作地中的占比分別為71.58%和76.93%、63.12%和80.08%、78.96%和 68.38%，可以看出，連作地含量高于非連作地的品種有綏陽小米辣和黔椒5號。3個辣椒品種中酯類物質相對質量分數整體呈現出連作地比非連作地高的規律。酚類物質中3個辣椒品種非連作地、連作地共有的物質為4-乙烯基-2-甲氧基苯酚。醛類物質中連作地比非連作地相對質量分數高的品種為綏陽小米辣和黔椒五號，香草醛除了在綏陽小米辣非連作地未被檢出，在其余5個處理中均檢出，且連作地含量明顯比非連作地占比高。

表1 辣椒盛花期根際土壤化學成分分析

注：“—”表示未檢測出。下表同。

表2 辣椒盛果期根際土壤化學成分分析

續表2

表3 辣椒盛花期根系化學成分分析

續表3

由表4可知，盛果期根系浸提液共檢測出11類共63種物質，其中酯類8種、酸類20種、酚類5種、醇類11種、酮類6種、醛類6種、酰胺類2種、其他類5種，總體比7月盛花期數量相對減少，但同樣以酸類最多，占31.75%，醇類次之，占17.46%。棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸在幾個品種中的相對質量分數較高。在黔椒5號、辣研2號、綏陽小米辣非連作及連作地根系中，酚類、酯類總相對質量分數連作地比非連作地高。酸類組分在綏陽小米辣和黔椒5號根系中呈連作地高于非連作地趨勢。酰胺類物質只有硬脂酸酰胺和油酸酰胺2種，且占比不是很高。水楊酸甲酯[18-20]、棕櫚酸甲酯[6，14，21-22]、硬脂酸甲酯[6]、苯甲酸[14-15]、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸[6]、硬脂酸[23-27]、香草酸[6]、花生酸[27]、苯甲醇[14]、葉綠醇[15，22]、苯甲醛[28]、香草醛[4-5，15]已在煙草等作物上被報道具有化感作用，它們在本研究中也被檢出，但是被檢相對質量分數較小。

表4 辣椒盛果期根系化學成分分析

續表4

3 結論與討論

從本研究可以看出，辣椒盛花期及盛果期根系及根際土壤的化學成分數目、種類及相對質量分數總體呈動態變化趨勢，如醇類物質是辣椒根系及土壤中檢測到的所有物質中占比較高的一類組分，不同時期均檢測出10種以上物質；烷類物質只在7月的連作土壤里檢出；酯類組分數目隨著生育期的推移，在土壤中呈小范圍上升趨勢；酮類成分在盛花期和盛果期的根際土壤中都被鑒定出4種有效組分，比辣椒根系的含量少2～3種；醛類物質隨著生育期的推后，在土壤中數量增多，在根系中減少。植株根系通過與土壤進行物質交換，通過乙酸途徑合成化感物質，根部酸性增加，土壤微生物在根部積累，自毒物質降低了植株生長能力和抵抗力，與多年累積的病原菌共同作用，形成嚴重的土傳病害，是連作障礙產生的重要原因[29]，關于其物質交換代謝機制及途徑有待深入研究。

不同辣椒品種、生育期及種植年限對辣椒根系及土壤化學成分的影響不同，主要是由于在辣椒生長階段根系會向土壤中分泌大量的根系分泌物，而有機酸是分泌物的主要成分，長期連作后，根系分泌物會在土壤中不斷積累[30]。如本研究中酚、酸類物質在7月即辣椒盛花期時，根系里共檢測出26種物質(其中許多物質是已被證實為具有化感作用的物質)，土壤中檢出2種；但通過1個生育期的積累即到辣椒盛果期時，根際土壤中酚、酸類物質的數目迅速提高到10種，根系的數目僅比之前減少1種，這種積累趨勢與諸多文獻報道一致。并且研究發現，當地品種綏陽小米辣連作地根際土壤中的酚、酸類物質數目增長速度最快，從最初的1種物質增長到10種，其酸類組分相對質量分數提高45.78百分點，明顯高于其非連作地和其他品種的處理，且根系中酚、酸類物質的初始相對質量分數比雜交品種黔椒5號(線椒)和辣研2號(朝天椒)平均數要高。相比之下，黔椒5號和辣研2號雖然在根系檢測出的酚、酸類物質也比較多，但在其連作地及非連作地土壤里的檢出量少且相對質量分數低。本研究可能從另外一個方向說明了生產中雜交種比本地自留種種植優勢強的一個原因，另外也驗證了根系分泌物和土壤化學成分隨著連作年限增加的變化規律，如馬云華等就黃瓜連作的研究表明，隨著連作年限的增加，土壤中酚酸類物質明顯積累[31]。本研究未能在土壤中檢測到與須文報道的主要化感物質為烷類、酯類等相似的化學成分，可能與連作時間長短、品種有關或者存在地區差異[32]。

現已有大量研究證實酚酸類物質的積累會加劇作物土傳病害發生等連作障礙，如隨酚酸類物質處理濃度的升高，土壤尖孢鐮刀菌和甜瓜疫霉菌數量呈持續上升趨勢，導致黃瓜枯萎病發生[31]。茄子根系分泌物中自毒物質香草醛和肉桂酸助長了茄子黃萎病的發生[33]。苯甲酸和肉桂酸處理可顯著提高西瓜幼苗枯萎病的發病率，隨著苯甲酸和肉桂酸處理濃度的提高，西瓜枯萎病病情指數和死苗率逐漸上升[34]。近年來，隨著辣椒經濟價值的日益增長，辣椒產業規模化發展，貴州地區因地理條件有限，辣椒連作已呈現不可阻擋的趨勢，然而連作障礙對作物品質及產量造成了不可估量的損害。本研究大致明確了當地品種綏陽小米辣以及雜交品種黔椒5號、辣研2號盛花期及盛果期植株根系及根際土壤化學成分，結合現有文獻報道的化感物質種類，解析了連作與非連作過程中酚酸類化感物質的積累規律，可對指導地方農業生產提供一定的理論支撐，對科學解決辣椒連作障礙有長遠意義，但是化感物質與品種的關系、不同活動時期變化規律、與微生物的關系、與環境的關系還有待進一步研究。