加味白頭翁散發酵產物對肉仔雞大腸桿菌病的防治效果及對其腸道菌群的影響

張 謙， 劉一塵， 徐 進， 李建正， 劉應鵬， 卜昌超， 雷連成

(1.吉林大學動物醫學學院，吉林長春 130062； 2.河南后羿實業集團有限公司，河南鄭州 625014； 3.河南科技大學動物科技學院，河南洛陽 471023)

肉雞大腸桿菌病是致病性大腸埃希氏菌引起的一種急性或慢性細菌性傳染病[1]，是重要的食源性人畜共患病原菌[2]。大腸桿菌血清型多，各血清型間交叉保護力低，疫苗免疫效果差，臨床上主要是依靠抗菌藥物進行預防和治療，但抗菌藥物的濫用導致多重耐藥、交叉耐藥、耐藥譜廣的大腸桿菌菌株不斷出現，大腸桿菌病普遍多發，給全球養禽業造成了巨大的經濟損失[3-4]。中草藥除具有無耐藥性、無殘留、能增強機體免疫機能等優點，還具有消除耐藥質粒[5-8]、抑制細菌被膜形成[9-11]的特點，因而成為畜禽疾病防治的研究熱點[12]。但中草藥作為天然藥物，存在藥效不理想、有效成分含量低、結構過于復雜等問題，限制了中草藥在畜禽養殖業中的應用。利用現代中草藥發酵技術[13]，可以提高中草藥活性成分含量，改變或產生一些中草藥中不具有的活性成分，將中藥的大分子物質，經過微生物轉化成為能夠被機體直接吸收的小分子成分，快速達到穩態血藥濃度，提高機體抗病能力。本研究采用加味白頭翁散及其發酵產物對野毒分離株大腸桿菌DE感染肉仔雞進行防治試驗，并檢測加味白頭翁散發酵產物對肉仔雞腸道菌群的影響，為加味白頭翁散發酵產物防治雞大腸桿菌病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

加味白頭翁散由白頭翁60 g、黃連30 g、黃柏45 g、秦皮60 g及黃芪45 g組成，加味白頭翁散發酵產物采用3%枯草芽孢桿菌固態發酵獲得，均由河南后羿實業集團有限公司提供。臨床用法、用量：混飼，2%預防劑量，4%治療劑量。野毒分離株大腸桿菌DE，由河南科技大學預防獸醫學實驗室提供；伊紅美蘭(eosin-methyleneblue，簡稱EMB)培養基、Pfizer瓊脂培養基、MRS培養基、BLB培養基及普通瓊脂培養基，均購自山東青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.2 試驗動物

2017年4月河南洛陽伊川某肉雞場提供1日齡AA白羽肉仔雞，于河南科技大學實驗牧場隔離飼養至5日齡后進行分組試驗。

1.3 試驗方法

1.3.1 肉仔雞大腸桿菌感染模型建立 將野毒分離株大腸桿菌DE在普通瓊脂平板上活化后，挑取單個菌落接種于LB液體培養基中，37 ℃、150 r/min條件下培養18～24 h，對細菌培養物用LB液體培養基10倍稀釋，使菌懸液濃度分別為 1×106、1×107、1×108、1×109CFU/mL。

10日齡AA白羽肉雞50羽，隨機分為A、B、C、D及對照組，A、B、C、D分別胸肌注射不同濃度梯度的菌懸液，對照組注射生理鹽水，注射量均為0.5 mL/羽。觀察并記錄72 h內試驗雞發病癥狀、死亡數量。及時剖檢死亡雞只，采集肝臟、心包分泌物，分離鑒定致病菌株為攻毒菌株。根據試驗結果計算半數致死量(LD50)并作為肉仔雞攻毒保護試驗的細菌濃度。采用Reed-muench累計法計算LD50，公式為lgLD50=高于50%死亡率的稀釋度的對數+距離比例值×稀釋倍數的對數；距離比例值 =(高于50%死亡率-50%)/(高于50%死亡率-低于50%死亡率)。

1.3.2 肉仔雞大腸桿菌攻毒防治試驗 選取180羽健康且體質量相近的5日齡健康白羽肉仔雞，隨機分為6組，每組3個重復，每個重復10羽，即Ⅰ組為加味白頭翁散發酵產物預防組，Ⅱ組為加味白頭翁散預防組，Ⅲ組為感染對照組，Ⅳ組為健康對照組，Ⅴ組為加味白頭翁散發酵產物治療組，Ⅵ組為加味白頭翁散治療組。

Ⅰ、Ⅱ組于攻毒前5 d連續飼喂含2%加味白頭翁散發酵產物、2%加味白頭翁散的基礎日糧；肉仔雞10日齡時，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組胸肌注射0.5 mL大腸桿菌菌液，濃度為“1.3.1”節中半數致死量濃度，Ⅳ組肉雞胸肌注射0.5 mL生理鹽水，然后，Ⅰ、Ⅴ組和Ⅱ、Ⅵ組分別繼續飼喂含4%加味白頭翁散發酵產物、4%加味白頭翁散的基礎日糧。在用藥防治試驗期間，觀察記錄各組肉仔雞發病、死亡等各項數據，計算試驗雞的發病率、死亡率、痊愈率及保護率。

1.4 數據分析

采用SPSS 20.0軟件對肉仔雞發病率、死亡率、痊愈率、保護率以及腸道菌群、抗氧化指標進行顯著性分析，結果以“平均值±標準差”表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 肉仔雞大腸桿菌感染模型建立

分別將濃度為1×106、1×107、1×108、1×109CFU/mL的野毒分離株大腸桿菌DE懸液進行攻毒試驗2 h后，試驗雞開始出現精神萎靡、采食減少或廢絕、畏寒扎堆，發病率可達90%以上；攻毒8 h后，試驗雞出現不同程度死亡。剖檢死亡雞只，出現心包炎、肝周炎及盲腸、十二指腸出血等典型的大腸桿菌病病變。分離鑒定致病菌株，均呈現野毒分離株大腸桿菌DE典型的染色特性及培養特性，可確定致病菌為野毒分離株大腸桿菌DE。

采用Reed-muench累計法計算野毒分離株大腸桿菌DE對試驗雞的半數致死量為LD50=106.33CFU/mL(表1)。最終確定野毒分離株大腸桿菌DE發病模型：細菌濃度為106.33CFU/mL，0.5 mL/羽，感染途徑為胸肌注射。

表1 野毒分離株大腸桿菌DE LD50測定

2.2 肉仔雞大腸桿菌攻毒防治試驗

野毒分離株大腸桿菌DE以半數致死劑量感染肉仔雞，進行攻毒保護試驗，2 h后，預防Ⅰ、Ⅱ組肉仔雞僅個別雞出現畏寒怕冷、精神不振等癥狀，未出現死亡情況，至試驗結束時，精神、飲食狀況恢復正常。感染Ⅲ組至8 h開始出現死亡，24～48 h出現死亡高峰，整個試驗過程中大部分雞出現精神不振、食欲減少等癥狀?？瞻讓φ战M雞精神、食欲、飲水正常，無雞死亡現象。治療Ⅴ、Ⅵ組12 h開始出現死亡，24～48 h 出現死亡高峰。

結果(表2)表明，預防Ⅰ組肉仔雞與感染對照Ⅲ組、治療Ⅴ組、Ⅵ組相比死亡率率明顯下降，保護率極顯著上升(P<0.01)，表明加味白頭翁散發酵產物對人工感染野毒分離株大腸桿菌DE的肉仔雞有較強的預防作用；預防Ⅱ組肉仔雞感染與對照Ⅲ組、治療Ⅴ組、Ⅵ組相比死亡率明顯下降，保護率極顯著上升(P<0.01)，表明加味白頭翁散對人工感染野毒分離株大腸桿菌DE的肉仔雞也具有較強的預防作用，但效果不如加味白頭翁散發酵產物。感染對照Ⅲ組、治療Ⅴ組、Ⅵ組的保護率差異不顯著。

表2 加味白頭翁散發酵產物對肉仔雞人工感染

注：同列數據后不同小寫字母、大寫字母分別表示差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。表3同。

2.3加味白頭翁散發酵產物對肉仔雞腸道菌群的影響

將大腸桿菌、腸球菌、乳酸菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌等的菌群數量采用SPSS 20.0進行顯著性分析，結果見表3。

由表3可見，預防Ⅰ組、Ⅱ組以及治療Ⅴ組、Ⅵ組肉仔雞盲腸中大腸桿菌的數量極顯著低于感染對照組(P<0.01)，均與健康對照組差異不顯著(P>0.05)；腸球菌、乳酸菌、雙歧桿菌及芽孢桿菌等的菌群數量均極顯著高于感染對照組(P<0.01)，預防組腸球菌、雙歧桿菌數量與健康對照組差異不顯著(P>0.05)，芽孢桿菌、乳酸菌數量與健康對照組差異極顯著(P<0.01)。預防Ⅰ組、Ⅱ組及治療Ⅴ組、Ⅵ組肉仔雞盲腸中大腸桿菌的菌群數量差異不顯著(P>0.05)；預防Ⅰ組、Ⅱ組肉仔雞盲腸中腸球菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌的菌群數量略高于治療Ⅴ組、Ⅵ組，差異極顯著(P<0.01)；預防Ⅰ組肉仔雞盲腸中芽孢桿菌、乳酸菌的菌群數量略高于預防Ⅱ組，差異顯著(P<0.05)。

表3 加味白頭翁散發酵產物對肉仔雞腸道菌群的影響

3 討論與結論

在抗生素選擇性壓力下，大腸桿菌耐藥菌株呈交叉耐藥和多重耐藥趨勢，而95%耐藥基因位于質粒、轉座子、整合子及噬菌體等可轉移遺傳元件上，從而造成細菌耐藥性的廣泛傳播。尤其是大腸桿菌耐藥性質粒，不僅可在同種、不同種微生物細胞間傳遞，而且可作為動物和人類抗生素耐藥基因庫，使耐藥基因通過食物鏈在動物抗生素耐藥共生菌和人體攜帶菌之間轉移。近年來研究表明，具抑菌作用的中草藥對大腸桿菌耐藥質粒有消除作用，如蒼術[5]、黃芩[6]、黃連[7]、地錦草[8]等。

大腸桿菌耐藥性還與大腸桿菌侵入機體器官或部位形成生物被膜有關聯。形成生物被膜的大腸桿菌進入一種饑餓的非生長狀態[14]，對抗生素幾乎完全不敏感；大腸桿菌的三維生物被膜結構可有效阻礙抗生素的穿透，在通常情況下，只有少量抗生素滲透到生物被膜內，其濃度并不足以有效殺滅深部細菌；大腸桿菌形成生物被膜后可隨著環境的變化具有特有的抗生素逃避機制。姚禹等研究表明，單味中藥、復方中藥或中藥單體對大腸桿菌生物被膜的形成具有很好的抑制作用[9-11]。

中草藥對腸道有益菌具有促生長作用，為益生菌的生長繁殖提供營養條件，增加腸道益生菌(如雙歧桿菌、乳酸菌、糞鏈球菌等)的種類和數量，抑制有害菌的生長和增殖，甚至還能抑制或殺滅有害菌，對動物機體健康發揮著關鍵作用[15]。而中草藥發酵是微生物在溫和條件下新陳代謝過程中產生纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等多種胞外酶系，降解植物細胞壁中的纖維素、半纖維素、果膠等成分，促進活性成分的釋放，催化其他營養物質進行氧化、酯化、甲基化和還原化等生物反應，最大限度地提取中草藥活性成分或轉化原成分，分解毒性物質，可促進藥物有效成分被吸收，以提高機體抗病能力[16-17]。

本研究結果表明，加味白頭翁散發酵產物對肉仔雞感染野毒分離株大腸桿菌DE的保護作用比加味白頭翁散強；加味白頭翁散及加味白頭翁散發酵產物對肉仔雞感染野毒分離株大腸桿菌DE的預防效果比治療效果好。加味白頭翁散及加味白頭翁散發酵產物處理的肉仔雞盲腸中大腸桿菌的菌群數量極顯著低于感染對照組(P<0.01)，腸球菌、乳酸菌、雙歧桿菌及芽孢桿菌的菌群數量均極顯著高于感染對照組(P<0.01)。飼喂加味白頭翁散發酵產物肉仔雞盲腸中大腸桿菌的菌群數量略低于飼喂加味白頭翁散，腸球菌、乳酸菌、雙歧桿菌及芽孢桿菌的菌群數量略高于飼喂加味白頭翁散，腸球菌、雙歧桿菌的菌群數量差異不顯著(P>0.05)，乳酸菌、芽孢桿菌的處理間差異顯著(P<0.05)。因此，加味白頭翁散發酵產物能有效預防肉仔雞大腸桿菌病，對恢復腸道微生態平衡、保持動物機體健康狀況具有重要作用，這也為加味白頭翁散發酵產物進一步臨床應用奠定了基礎。