超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法直接測(cè)定地表水中殘留的惡喹酸

張 玉，吳佳倫，吳曉峰，李 佳，陳 勇

(1. 彭州市環(huán)境監(jiān)測(cè)站，四川 成都 611930; 2. 成都市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，四川 成都 610072)

0 引 言

惡喹酸是一種喹諾酮類殺菌劑，其分子式為C13H11NO5，分子量為261.23。惡喹酸在水中的溶解度為3 μg/L。惡喹酸對(duì)真菌無(wú)活性，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌活性較弱，而對(duì)革蘭陰性菌具有廣范圍的抗菌活性，其可以在細(xì)菌的菌體內(nèi)，與對(duì)于DNA的超卷曲結(jié)構(gòu)導(dǎo)入反向超卷曲的酶的亞組A結(jié)合，使其機(jī)能受抑制而使DNA無(wú)法復(fù)制，從而抑制DNA的合成來(lái)阻礙病菌分裂和增殖，因此惡喹酸常被應(yīng)用于防治洋蔥球莖軟腐病、水稻谷枯細(xì)菌病以及多種魚(yú)類疾病[1-3]。但是，在不規(guī)范使用的情況下，惡喹酸可能通過(guò)雨水沖洗或澆灌，淋溶進(jìn)入水庫(kù)、湖泊等水體，并通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體。基于細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性產(chǎn)生的認(rèn)識(shí)以及某些喹諾酮類抗生素，如萘啶酸，顯示的致癌、致突變、干擾生殖系統(tǒng)、誘發(fā)光過(guò)敏等毒性的認(rèn)識(shí)，惡喹酸在水體中的殘留對(duì)人類及整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)可能構(gòu)成長(zhǎng)期潛在的威脅[4-8]。

目前關(guān)于檢測(cè)惡喹酸殘留的報(bào)道有很多，主要有高效液相色譜/熒光檢測(cè)法[9-11]、紫外分光光度法[12]、酶聯(lián)免疫吸附法[13]和高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法。其中，高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法，由于具有靈敏度高、應(yīng)用范圍廣、抗干擾能力強(qiáng)、操作方法簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于惡喹酸殘留的檢測(cè)[14-17]。惠欣欣等[1]建立了用高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定洋蔥中惡喹酸殘留量的快速檢測(cè)方法；丁濤[18]等使用高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中殘留的19種喹諾酮類藥物；楊方等[19]用高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)了水產(chǎn)品中15種喹諾酮類藥物的殘留量。目前使用高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)惡喹酸的測(cè)量已涉及食品、化妝品和水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面，但對(duì)環(huán)境地表水中惡喹酸殘留的研究尚且不多[20]。由于惡喹酸在地表水中的累積可能會(huì)造成本底的增高及耐藥性的出現(xiàn)，對(duì)環(huán)境保護(hù)造成巨大的挑戰(zhàn)，因此對(duì)地表水中惡喹酸殘留進(jìn)行檢測(cè)具有重要意義。

本文建立高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法，對(duì)地表水中的惡喹酸殘留過(guò)濾后直接進(jìn)行測(cè)量。優(yōu)化了HPLC-MS/MS條件，用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子掃描方式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，外標(biāo)法定量，并對(duì)不同溶劑比例、添加劑甲酸的加入和基質(zhì)效應(yīng)對(duì)惡喹酸的信號(hào)影響進(jìn)行了比較。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備及試劑

Agilent 1290-6460超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)）；ACQuITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）色譜柱；ELGA Purelab ultra Analytical純水制備裝置（英國(guó)）。Agilent PTFE-Q（聚四氟乙烯）0.2 μm 針式過(guò)濾器。

惡喹酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海西隴生化科技有限公司。甲酸為HPLC級(jí)，購(gòu)于上海安譜公司。甲醇為HPLC級(jí)，購(gòu)于Fisher Chemical公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水 ELGA Purelab ultra Analytical純水系統(tǒng)制備。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱取定量惡喹酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇定容至100 mL，配制成 260 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。然后稀釋成13 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，于–20 ℃下避光保存。

1.2 HPLC-MS/MS條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；柱溫：30 ℃。

流動(dòng)相：體積比為15:85的0.1%的甲酸水溶液：甲醇；流量：0.25 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL。

1.2.2 三重四級(jí)桿質(zhì)譜條件

參數(shù)優(yōu)化方式為SCAN模式和Productor ion模式，檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子掃描模式；碰撞氣為高純氮?dú)猓桓稍餁鉁囟?50 ℃；干燥氣流量 13 L/min;霧化器壓力 60 psi（1 psi=6.895 kPa）；鞘氣溫度 400 ℃，鞘氣流量12 L/min；毛細(xì)管電壓（正）2 000 V；噴口電壓（正）500 V。

惡喹酸質(zhì)譜分子參數(shù)見(jiàn)表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

將地表水過(guò)0.2 μm親水相針式過(guò)濾器，去除水樣中的雜質(zhì)后，裝入樣品瓶中。加入相應(yīng)量的甲醇和惡喹酸標(biāo)液，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

表1 惡喹酸質(zhì)譜分子參數(shù)1）

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溶劑比例對(duì)惡喹酸響應(yīng)的影響

樣品的溶劑組成比例對(duì)色譜峰影響很大，因此本實(shí)驗(yàn)使用不同比例的甲醇-水溶劑配制濃度為7.8 μg/L的惡喹酸溶液，比較惡喹酸的信號(hào)響應(yīng)，結(jié)果如圖1所示。其中，從1到11，甲醇比例依次為：0%、 10%、 20%、30%、40%、 50%、 60%、 70%、80%、 90%、 100%。在各比例下，惡喹酸的峰形都較好，基線平穩(wěn)，信噪比高，沒(méi)有出現(xiàn)峰分裂；但當(dāng)選用60%、70%、80%、90%的甲醇作為樣品溶劑時(shí)，惡喹酸的信號(hào)響應(yīng)明顯高于溶劑中甲醇比例為0%、10%、20%、30%、40%、50%、100%時(shí)。推測(cè)該現(xiàn)象可能是惡奎酸的離子化程度與溶解度綜合作用的結(jié)果：電噴霧離子化過(guò)程中，帶電液滴表面積減小，表面電荷密度增大，當(dāng)電荷間靜電排斥力超過(guò)表面張力時(shí)初始液滴發(fā)生庫(kù)倫爆炸產(chǎn)生小液滴，小液滴發(fā)生崩散，逐步釋放出液滴表面多余的電荷直至釋放氣相離子，水的表面張力大，使得初始液滴大，爆炸形成小液滴困難，需要較長(zhǎng)時(shí)間來(lái)進(jìn)行溶劑蒸發(fā)，而水的揮發(fā)性低導(dǎo)致氣相離子釋放效率下降；此外，水的高粘度導(dǎo)致離子電泳遷移率低以及水的極性產(chǎn)生的溶劑化作用使得分析物呈中性而不能被檢測(cè)器識(shí)別等原因也可能導(dǎo)致離子化效率下降[21-23]。但惡奎酸25 ℃時(shí)在甲醇中的溶解度小于1.0%，在水中的溶解度為0.003 mg/L，因此當(dāng)溶劑全部為甲醇時(shí)，可能會(huì)降低惡奎酸的溶解度，導(dǎo)致信號(hào)響應(yīng)降低。所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將對(duì)60%、70%、80%、90%的甲醇作為溶劑進(jìn)行進(jìn)一步探討。

圖1 不同溶劑比例對(duì)惡喹酸響應(yīng)的影響

2.2 甲酸對(duì)惡喹酸信號(hào)響應(yīng)的影響

在液相色譜的流動(dòng)相中加入添加劑可以改善色譜分離度，改善峰形，提高電噴霧離子化效率。基于此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了在樣品配制時(shí)甲酸的加入對(duì)惡喹酸響應(yīng)信號(hào)的影響。分別以60%、70%、80%、90% 的甲醇作為樣品溶劑，在 2.6，52，78 μg/L 3個(gè)濃度水平下，比較加入甲酸（0.1%）與不加甲酸的區(qū)別。根據(jù)圖2中惡喹酸的出峰情況可得出，在相同甲醇比例和相同惡喹酸濃度下，加入甲酸后的響應(yīng)信號(hào)明顯低于不加甲酸。出現(xiàn)該現(xiàn)象可能是因?yàn)榧姿崤c惡奎酸在離子化過(guò)程中競(jìng)爭(zhēng)液滴表面過(guò)剩電荷，產(chǎn)生了離子抑制現(xiàn)象。故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中配制樣品時(shí)均不加入甲酸。

圖2 甲酸對(duì)惡喹酸信號(hào)響應(yīng)的影響（“+”為加入甲酸；“–”為不加入甲酸）

2.3 基質(zhì)效應(yīng)對(duì)直接測(cè)定惡喹酸信號(hào)響應(yīng)的影響

在HPLC-MS/MS檢測(cè)中，分析物共流出組分會(huì)直接影響電噴霧的離子化效果和檢測(cè)信號(hào)的增強(qiáng)或抑制。為研究地表水的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)直接測(cè)定惡喹酸的影響，本實(shí)驗(yàn)將超純水與地表水在甲醇比例分別為 60%、70%、80%、90%時(shí)，在 2.6，52，78 μg/L 3個(gè)濃度水平上的惡喹酸出峰情況進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果如圖3所示，在相同甲醇比例和相同濃度水平下，均基線平穩(wěn)、信噪比高、峰形一致、沒(méi)有出現(xiàn)峰分裂；當(dāng)甲醇比例為60%和90%時(shí)超純水與所測(cè)兩種地表水的惡喹酸峰高存在微小差異；當(dāng)甲醇比例為70%和80%時(shí)，峰高基本一致。因此，選擇甲醇比例為80%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 基質(zhì)效應(yīng)對(duì)惡喹酸信號(hào)響應(yīng)的影響

2.4 方法性能指標(biāo)

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

在最優(yōu)條件下，加入惡喹酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為 0.13，0.52，1.04，3.9，7.8，13，26，52，78 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列。以濃度為橫坐標(biāo)，相對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，結(jié)果如圖4所示。在 0.13～78 μg/L 范圍內(nèi)線性良好，線性方程為y=0.595 9x+1.378 8，線性相關(guān)系數(shù)為r2=0.999 2，方法檢出限為0.036 μg/L。線性范圍內(nèi)，各濃度水平均連續(xù)進(jìn)樣3次，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4.3%。

圖4 惡喹酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

取兩種地表水樣品，分別添加1.04，3.9 μg/L濃度水平的惡喹酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。在最優(yōu)條件下，每個(gè)添加水平平行測(cè)定10次，計(jì)算其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好，各項(xiàng)指標(biāo)能夠滿足殘留分析的要求。

表2 兩種地表水中惡喹酸的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=10）

2.4.3 樣品檢測(cè)

為驗(yàn)證方法的實(shí)用性和準(zhǔn)確性，應(yīng)用該方法對(duì)3條河流的地表水共15個(gè)樣品進(jìn)行惡喹酸含量的測(cè)定。測(cè)定結(jié)果表明，被測(cè)的15個(gè)水樣均未檢出惡喹酸殘留。

2.5 惡喹酸的檢測(cè)方法對(duì)比

目前已知的對(duì)地表水或廢水中的惡喹酸殘留進(jìn)行檢測(cè)的方法中，大多需要進(jìn)行固相萃取等前處理過(guò)程[24-25]。但前處理過(guò)程通常存在操作步驟繁瑣，需耗費(fèi)相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間；使用大量有機(jī)溶劑，可能造成環(huán)境污染；工作量大，不利于批量檢測(cè)；操作步驟多，使用試劑多，引入誤差的可能性增多，影響回收率的因素多等缺點(diǎn)。因此，設(shè)計(jì)一個(gè)能夠快速直接測(cè)定樣品濃度的方法很有必要。

3 結(jié)束語(yǔ)

惡喹酸在地表水中的累積可能會(huì)造成本底的增高及耐藥性的出現(xiàn)，對(duì)環(huán)境保護(hù)造成巨大的挑戰(zhàn)，因此對(duì)地表水中惡喹酸殘留進(jìn)行檢測(cè)具有重要意義。本文建立了超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀直接測(cè)定過(guò)濾后的地表水中惡喹酸殘留的分析方法。考察了不同溶劑比例下惡喹酸信號(hào)響應(yīng)的差別，得出在一定范圍內(nèi)，甲醇比例越高，惡喹酸峰信號(hào)響應(yīng)越強(qiáng)。比較了甲酸的加入對(duì)峰信號(hào)的影響，得出在配制樣品時(shí)加入甲酸會(huì)減小峰響應(yīng)。并討論了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)惡喹酸檢測(cè)的作用。在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子掃描方式下，用外標(biāo)法定量，對(duì)影響回收率和重現(xiàn)性的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，在0.13～78 μg/L范圍內(nèi)進(jìn)行定量分析，結(jié)果線性良好，檢出限為0.036 μg/L。該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速、重現(xiàn)性好，適用于直接測(cè)定過(guò)濾后地表水中惡喹酸的殘留。該方法可以對(duì)環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域地表水中惡喹酸的檢測(cè)提供有用信息。接下來(lái)將對(duì)采用HPLC-MS/MS同時(shí)直接測(cè)定地表水中多種抗生素的方法進(jìn)行進(jìn)一步研究。