檸檬明串珠菌TD1產胞外多糖條件的響應面法優化及其抗氧化性研究

葉廣彬，陳源紅，王長麗，楊睿睿，賓曉蕓，銀聯飛*

（右江民族醫學院，廣西 百色 533000）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類能夠利用碳水化合物產生大量乳酸的細菌，作為公認安全的益生菌，乳酸菌具有促進腸道有益微生物的生長、緩解乳糖不耐癥、降低膽固醇、抗氧化等優點，廣泛應用在工業、農業、食品、醫學等領域[1-2]。乳酸菌胞外多糖（expolysaccharides，EPS）是乳酸菌在生長代謝過程中發酵產生并分泌到細胞外的黏液或莢膜多糖，是一種天然高分子聚合物[3]。能夠產生EPS的乳酸菌主要包括：片球菌屬（Pediococcus）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、檸檬明串株菌（Leu.citreum）、魏斯氏菌（Weissella）、干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）、德氏乳桿菌（Lb.delbruecckii）、瑞士乳桿菌（Lb.helveticus）、馬乳酒樣乳桿菌（Lb.kefiranofaciens）、嗜酸乳桿菌（Lb.acidophilus）、乳酸乳球菌（Lc.1actis）、嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）等[4-6]。其中20世紀40年代開發出的由Leu.mesenteroides產生的右旋糖酐是最早被開發利用的乳酸菌胞外多糖，也是美國食品藥品監督管理局（food and drug admin istration，FDA）批準的第一種可用于食品的微生物EPS[7]。大量研究表明，乳酸菌胞外多糖具有降低膽固醇、抗氧化、抗腫瘤、調節消化道等特點，能夠使微生物在脫水、營養缺乏、有毒物質、噬菌體、滲透壓和拮抗物等不利條件下生存[8-9]。目前，乳酸菌胞外多糖已作為穩定劑、增稠劑被用于酸奶、奶酪等發酵奶制品的生產中[10]。

EPS的生物合成因菌種不同而發生在生長的不同階段和環境條件下，按合成位點和合成模式的不同，EPS分為位于細胞壁外合成的同型多糖與位于細胞膜上合成的異型多糖，分子質量在4.0×104～6.0×106Da[11]。同型多糖的合成為不依賴C55-lipid-pp的合成模式，異型多糖的合成則為依賴C55-lipid-pp的合成模式[12]。近幾十年來，由于微生物EPS在產品結構、性能及生產方面所具有的特別優勢而得到大力研究和開發，新的微生物EPS的開發已成為工業微生物研究的熱點之一[13]。然而國內眾多學者對EPS的研究，主要集中在真菌多糖（如靈芝多糖、蟲草多糖和香菇多糖等[14]）。LAB作為食品級工業生產菌，與其他微生物相比安全性高。隨著對LAB研究的不斷深入，LAB EPS因具有益生功能逐漸引起研究者的關注[3]，然而EPS產量低，菌株穩定性差，是制約其大規模生產的主要因素[15]。此外，由于LAB對生長條件較為苛刻，培養基成分較為復雜，發酵條件的微小改變都會顯著影響EPS的產量。

本課題組之前從東北自然酸菜發酵液中分離得到多株高產EPS的LAB，通過一系列生物化學方法鑒定其種屬地位，并利用單因素試驗考察了培養基組分及培養條件對EPS產量的影響。本研究為了提高目標菌株的EPS產量，滿足工業化生產需求，在單因素試驗的基礎上通過響應面法優化菌株產EPS能力，并探索其抗氧化性質，為該EPS的分離純化奠定基礎，為益生元特性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）TD1：分離自東北自然發酵酸菜樣品。葡萄糖、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、K2HPO4、無水乙酸鈉、檸檬酸銨、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、吐溫80、硫酸、苯酚、乙醇、三氯乙酸、過硫酸鉀、鄰苯三酚、水楊酸、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺等（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.2 培養基

初始發酵培養基：蔗糖80 g/L，酵母提取物8 g/L，牛肉膏12 g/L，蛋白胨12 g/L，無水乙酸鈉6 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·H2O 0.25 g/L，檸檬酸銨2 g/L，吐溫80 1 mL/L，121℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；5804R型離心機：德國Eppendorf公司；DHP-420電熱恒溫培養箱：天津中環實驗電爐有限公司；SPX-100B-D振蕩培養箱：上海博訊實業有限公司；FE20 pH計：梅特勒-托利多（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 EPS的提取

取500 mL發酵液，于4 ℃、4 000×g條件下離心60 min，取上清。上清液加入3倍體積的預冷體積分數95%的乙醇，醇沉過夜，4℃、12000×g離心40min收集多糖沉淀，用250mL超純水30～40℃溶解多糖沉淀，加入250mL 10%三氯乙酸，充分攪拌4℃靜置10 h，4℃、12 000×g離心40 min收集上清液。隨后再次加入3倍體積的預冷體積分數95%的乙醇，醇沉過夜，4℃、12 000×g離心40 min收集多糖沉淀，重溶于超純水中，裝入透析袋（截留分子量14 000 Da）中，4℃透析2 d，每8 h換一次水。

1.3.2 EPS含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定EPS的含量，將1 mL EPS樣品與1 mL體積分數6%的苯酚溶液、5 mL濃硫酸溶液混勻，靜置冷卻至室溫后，于波長490nm處測定吸光度值。以葡萄糖為標準制作標準曲線[16]，根據標準曲線計算EPS的含量。

1.3.3 Plackett-Burman試驗設計

Plackett-Burman（PB）試驗設計是響應面試驗設計的一種，用于中心組合試驗之前挑選優化因素的一種試驗設計方法。依據DU RP等[17]的方法，選擇影響EPS產量的10個因素蔗糖（X1）、蛋白胨（X2）、Ca2+濃度（X3）、酵母提取物（X4）、無水乙酸鈉（X5）、牛肉膏（X6）、初始pH值（X7）、裝液量（X8）、搖床轉速（X9）、培養溫度（X10），以EPS產量（Y）為響應值，選取N=12的PB試驗設計對影響EPS產量的10個因素的顯著性進行考察，將每個因素分為高（+1）、低（-1）2個水平。PB試驗設計因素與水平見表1。

表1 兩水平析因試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of factorial tests with two levels

1.3.4 響應面分析試驗設計

根據PB試驗的結果，以EPS產量（Y）為響應值，對EPS產量的影響因素蔗糖（X1）、Ca2+濃度（X3）、無水乙酸鈉（X5），進行響應面分析試驗，得到最優方案。響應面試驗設計因素與水平見表2。

表2 菌株TD1產胞外多糖條件優化中心組合設計因素與水平Table 2 Factors and levels of central composite design for the conditions optimization of EPS production by strain TD1

1.3.5 測定方法

超氧陰離子自由基清除率：按照參考文獻[18]的方法測定；羥基自由基清除率：按照參考文獻[19]的方法測定；DPPH自由基清除率：按照參考文獻[20]的方法測定。NO2-清除率：按照參考文獻[21]的方法測定。

2 結果與分析

2.1 供試菌Leu.citreum TD1培養條件優化

2.1.1 顯著因素篩選結果

在對Leu.citreum TD1產EPS單因素條件研究基礎上，通過兩水平析因設計篩選對產EPS影響顯著的因素，試驗設計及結果見表3，回歸分析結果見表4。

表3 兩水平析因設計試驗結果Table 3 Results of factorial design tests with two levels

表4 兩水平析因設計回歸分析結果Table 4 Regression analysis results of factorial design with two levels

由表3、表4可知，兩水平析因試驗模型項顯著（P=0.0436＜0.05），R2=0.954 7，調整R2=0.996 5，二者均接近1，信噪比=49.804（＞4），表明模型能夠很好的擬合試驗數據。各變量對響應值影響顯著程度依次為X1＞X5＞X3＞X6＞X4＞X7＞X8＞X9＞X2＞X10，即蔗糖（X1）、Ca2+濃度（X3）和無水乙酸鈉（X5）對Leu.citreum TD1產EPS有顯著影響（P＜0.05）。其他變量在本研究條件下對發酵液EPS含量無顯著影響。

模型擬合方程為TD1 EPS含量=19.893 33+0.503 83X1-0.062 500X2-1.181 67X3+1.267 50X4+3.336 67X5-30.833 33X6-1.233 33X7+0.110 00X8+0.361 67X9+0.034 667X9。

2.1.2 顯著因素水平優化結果

菌株TD1產胞外多糖條件優化中心組合試驗結果見表5，回歸分析見表6。

表5 菌株TD1產胞外多糖條件優化中心組合試驗結果Table 5 Results of central composite tests for the conditions optimization of EPS production by strain TD1

表6 中心組合設計回歸分析結果Table 6 Regression analysis results of center composite design

由回歸分析（表6）可知，模型項極顯著（P＜0.000 1＜0.05），失擬合項不顯著（P=0.372 0＞0.05），R2=0.948 4，調整R2=0.902 0，信噪比=33.810（＞4），表明模型能夠很好的擬合試驗數據。X5、X1X3、X1X5、X3X5對產EPS無顯著影響（P＞0.05）；X52對產EPS有顯著影響（P＜0.05）；X1、X3、X12、X32對產EPS有極顯著影響（P＜0.01）。

各因素及交互作用對Leu.citreum TD1產EPS影響如圖1所示。

圖1 顯著影響Leuconostoc citreum TD1產EPS的各因素交互作用響應面圖Fig.1 Response surface plots of interaction of each factors significantly affecting the EPS production by Leuconostoc citreum TD1

模型擬合方程為：TD1 EPS含量（g/L）=4.83-4.83X1+0.94X3-0.36X5-1.12X1X3-4.06X1X5-0.34X3X5-6.61X12-1.89X32-1.82X52。式中二次項系數均為負值，可知方程有極大值，擬合曲面開口朝下。預測蔗糖為108.99 g/L、Ca2+濃度為0.21 mmol/L、無水乙酸鈉為6.66 g/L時，TD1 EPS含量達到最大值56.60 g/L。

2.1.3 最優產TD1 EPS條件驗證結果

為方便實際操作，修改培養條件為蔗糖為109 g/L、Ca2+濃度為0.2 mmol/L、無水乙酸鈉為6.7 g/L，在此條件下，TD1 EPS含量為（57.58±2.04）g/mL，與預測值56.60 g/L無顯著差異（P＞0.05），即中心組合試驗優化模型擬合性良好，結果可靠。本研究中響應面法優化后，Leu.citreum TD1產EPS水平是優化前（32.71 U/mL）的1.76倍。

2.2 供試菌Leu.citreum TD1 EPS抗氧化作用

2.2.1 對O2-·的清除作用

圖2 EPS對O2-·的清除曲線Fig.2 Scavenging curve of EPS to O 2-·

由圖2可知，隨著TD1 EPS和維生素C（vitamin C，VC）質量濃度的增大，清除率呈現先急速升高后保持平穩的趨勢，當質量濃度＞0.063 2 mg/mL時，清除率提高幅度明顯減小，在質量濃度為0.252 6 mg/mL時，TD1 EPS和VC對O2-·的清除率達到最大，分別為（55.23±2.18）%和（87.72±1.71）%。研究表明，O2-·是一種較弱的氧化劑，在機體中可以通過歧化作用等其他反應產生過氧化物和羥自由基，從而對機體產生一定損傷[22]。戚躍明等[23]研究EPS對O2-·清除能力發現，在質量濃度為10mg/mL時，O2-·清除率達到47.4%，顯著低于本研究中的EPS清除效率（P＜0.05）。由此可以看出，TD1 EPS對O2-·具有一定的清除活性，其作為添加劑可以降低機體的損傷程度。

2.2.2 對·OH的清除作用

圖3 EPS對·OH的清除曲線Fig.3 Scavenging curve of EPS to·OH

由圖3可知，隨TD1 EPS和VC質量濃度的增加，·OH的清除率呈現先升高后趨于平緩的趨勢。在質量濃度為0～0.5mg/mL時，VC對·OH的清除率始終高于TD1EPS對·OH的清除率，而質量濃度在0.5～1.0mg/mL時，TD1EPS對·OH的清除率要高于VC對·OH的清除率。當質量濃度達到1.0mg/mL時，二者對·OH的清除率分別達到（95.34±2.33）%（EPS）和（90.76±2.98）%（VC）。崔靜等[24]發現ESP6對·OH具有明顯的清除作用，在質量濃度為2.0 mg/mL時，清除率高達91.5%，顯著低于本研究中TD1 EPS對·OH的清除作用。

2.2.3 對DPPH自由基的清除作用

圖4 EPS對DPPH自由基的清除曲線Fig.4 Scavenging curve of EPS to DPPH radicals

由圖4可知，隨TD1 EPS和VC質量濃度的增加，DPPH自由基清除率逐漸上升，且呈現一定的量效關系。當EPS和VC的質量濃度為1.0 mg/mL時，DPPH自由基清除率分別達到（56.61±3.09）%和（87.54±2.17）%。而相較于VC，TD1 EPS的DPPH自由基清除率相對較弱。DPPH是一類較為穩定的合成自由基，其穩定性主要源于共振穩定作用及苯環的空間障礙作用。若能將DPPH清除，則表明受試化學物質具有較強的自由基清除能力。張玉龍等[25]研究不同種類ESP對DPPH的清除能力時發現，當ESP質量濃度為1.0 mg/mL時，其對DPPH的清除率為33.53%～41.92%，低于本研究中EPS對DPPH自由基清除率。TD1 EPS具有DPPH自由基有清除能力可能是由于多糖中的羥基具有供氫質體能力的結果。

2.2.4 對NO2-的清除作用

圖5 EPS對NO2-的清除曲線Fig.5 Scavenging curve of EPS to NO 2-

硝酸鹽在酸性條件下可轉變成的亞硝酸，亞硝酸具有較強的氧化性，可將血液中的二價鐵離子氧化成三價鐵離子，進而使血紅蛋白轉變成高鐵血紅蛋白，失去結合氧的能力，從而引起組織缺氧，急性中毒[26]。此外，亞硝酸可與胺類物質反應，生成具有強致癌作用的亞硝基胺類化合物，誘發人消化道癌等疾病。尤其是在發酵食品中，亞硝酸鹽的控制十分重要。大量研究表明，在食品（如酸菜）發酵過程中添加VC，可以有效地降解亞硝酸鹽，提高發酵制品的安全性[27]。由圖5可知，在濃度較低的情況下，NO2-的清除率與TD1 ESP濃度呈現正相關，但清除率均小于VC。在質量濃度為0.5 mg/mL時，NO2-的清除率分別為（5.32±0.18）%（TD1 EPS）和（10.89±2.11）%（VC）。之后，隨著濃度的升高，NO2-的清除率升高較為緩慢。因此可以看出，TD1 EPS對亞硝酸鹽具有一定的清除能力，在作為添加劑替代VC用于食品發酵上具有潛在的應用價值。

3 結論

本研究以Leu.citreum TD1為供試菌株，采用響應面方法通過三步試驗設計的優化菌株產EPS條件。首先，兩水平析因試驗設計結果表明，蔗糖、Ca2+和無水乙酸鈉對Leu.citreum TD1產EPS有顯著影響。然后，中心組合設計預測培養基中蔗糖為109 g/L、Ca2+為0.2 mmol/L和無水乙酸鈉為6.7 g/L時，EPS含量達到最大值56.60 g/L。在此優化條件下，TD1 EPS含量為（57.58±2.04）g/L，是優化前（32.71 g/L）的1.76倍。TD1 EPS對超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基和NO2-均具有良好的抗氧化活性，清除效率隨著濃度的增加而增強，最高分別為（55.23±2.18）%、（95.34±2.33）%、（56.61±3.09）%和（5.32±0.18）%。因此，Leu.citreum TD1發酵得到的EPS作為天然抗氧化劑具有廣闊的應用和開發前景。