不同液態(tài)發(fā)酵基質(zhì)對紅曲霉產(chǎn)紅曲色素及桔霉素的影響

吳 宏，代文婷，連喜軍，郭安民，吳洪斌

（1.新疆農(nóng)墾科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子 832000；2.新疆農(nóng)墾科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，新疆 石河子 832000；3.天津商業(yè)大學 天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

紅曲霉菌（Monascus）屬于真菌界，子囊菌門，子囊菌綱，散囊菌目，紅曲科，由法國科學家Van Tieghem于1884年分類并命名[1]。中國紅曲發(fā)酵始于唐朝，主要用于腐乳、民間醫(yī)藥、食品著色劑、發(fā)酵劑和紅米酒[2]。紅曲色素是紅曲霉代謝過程中產(chǎn)生的系列聚酮類化合物，是微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)的天然色素，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化妝品領(lǐng)域[3-5]。紅曲色素的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式為固態(tài)發(fā)酵，其生產(chǎn)率低，耗糧多，而液體發(fā)酵具有生產(chǎn)周期短、工藝簡便、安全性高的特性[6]。目前，優(yōu)化紅曲菌發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)及條件是提高紅曲色素生產(chǎn)水平和降低桔霉素含量的有效途徑之一[7]。桔霉素是紅曲霉代謝產(chǎn)生的一種真菌毒素，具有顯著的腎毒性、肝毒性、致癌、致畸性及免疫毒性[8-12]。自法國科學家Blanc1995年首次在紅曲中發(fā)現(xiàn)強毒性桔霉素后，國內(nèi)外針對紅曲產(chǎn)品的安全性提出了制約條件。日本規(guī)定紅曲色素中桔霉素限制標準為0.2 mg/kg[13]。美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）規(guī)定紅曲色素中含有的桔霉素安全性合格后才能作為食品添加劑使用。歐洲規(guī)定了只允許不含桔霉素的產(chǎn)品進口和銷售[14-15]。

該研究在前期新疆及其他地區(qū)腐乳中分離純化得到的10株紅曲菌的基礎(chǔ)上，經(jīng)過18種液體培養(yǎng)基發(fā)酵，分析其次級代謝產(chǎn)物——紅色素和桔霉素，篩選出產(chǎn)紅色素能力強、低產(chǎn)或不產(chǎn)桔霉素的菌株。通過探索不同地區(qū)紅曲霉的紅色素產(chǎn)量以及產(chǎn)桔霉素的特性，以期為紅曲霉在食品工業(yè)中更好地發(fā)揮作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要材料

10株紅曲霉菌為本實驗室前期從不同地區(qū)腐乳中分離純化得到[16]，其中紅曲霉菌“連天津”為實驗室現(xiàn)有紅曲霉；ZBX新疆：分離自新疆大塊紅腐乳；BCQ吉林：分離自吉林朱老六紅腐乳；BCQ廣東：分離自廣東廣利達南乳紅腐乳；ZBX天津：分離自天津利民紅腐乳；BCQ（D）：分離自北京老才臣大塊紅腐乳；ZBX（8）：分離自北京老才臣玫瑰腐乳；ZBX（D）：分離自北京王致和大塊紅腐乳；9（M）：分離自北京王致和玫瑰腐乳；9（H）：分離自北京王致和紅辣腐乳。

1.1.2 主要試劑

大豆分離蛋白（食品級）：谷神生物科技集團有限公司；堿性蛋白酶（2×106U/g，食品級）：天津濱海諾奧科技發(fā)展有限公司；紅曲紅素標準品（純度≥99.0%）：上海洽姆儀器科技有限公司；蛋白胨、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；YX-18LM手提式壓力蒸汽滅菌器高壓鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；L535-1低速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HNY-111C恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；TU-1901分光光度計：北京譜析責任有限公司；LCQ-Advantage液質(zhì)（liquid chromatographymass spectrometr，LC-MS）聯(lián)用儀：美國Thermo-Finnigan公司。

1.3 方法

分別用麥芽糖、葡萄糖和蔗糖為碳源，并分別以蛋白胨、大豆分離蛋白、大豆分離蛋白堿性蛋白酶水解液、面筋堿性蛋白酶水解液、堿溶蛋白堿性蛋白酶水解液和醇溶蛋白堿性蛋白酶水解液做氮源，制成18種發(fā)酵培養(yǎng)基，將新疆和其他地區(qū)分離得到的10株紅曲霉菌株分別于18種液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，然后進行發(fā)酵代謝產(chǎn)物紅曲色素和桔霉素的吸光度值測定和質(zhì)譜分析，最終確定適合的紅曲霉液體培養(yǎng)基和高產(chǎn)紅曲色素低產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株。

1.3.1 紅曲霉液體培養(yǎng)基的制備

（1）制備大豆分離蛋白堿性蛋白酶水解液：將7%的大豆分離蛋白水溶液煮開放涼，用NaOH調(diào)節(jié)pH=8.0，加入0.1%的堿性蛋白酶，于55℃恒溫條件下酶解5 h；

（2）制備面筋堿性蛋白酶水解液：將7%的面筋水溶液煮開放涼，用NaOH調(diào)節(jié)pH=8.0，加入0.1%的堿性蛋白酶，于55℃恒溫條件下酶解5 h；

（3）制備堿溶蛋白堿性蛋白酶水解液：將7%的堿溶蛋白水溶液煮開放涼，用NaOH調(diào)節(jié)pH=8.0，加入0.1%的堿性蛋白酶，于55℃恒溫條件下酶解5 h；

（4）制備醇溶蛋白堿性蛋白酶水解液：將7%的醇溶蛋白水溶液煮開放涼，用NaOH調(diào)節(jié)pH=8.0，加入0.1%的堿性蛋白酶，于55℃恒溫條件下酶解5 h；

（5）分別用麥芽糖、葡萄糖和蔗糖為碳源，以蛋白胨、大豆分離蛋白、大豆分離蛋白堿性蛋白酶水酶解液、面筋堿性蛋白酶水解液、堿溶蛋白堿性蛋白酶水解液和醇溶蛋白堿性蛋白酶水解液作氮源，制作18種發(fā)酵培養(yǎng)基，通過后續(xù)發(fā)酵確定最適培養(yǎng)基組成。培養(yǎng)基設(shè)計：100 mL發(fā)酵液：添加3%碳源+1%氮源，①代表蛋白胨，②代表大豆分離蛋白，③代表大豆分離蛋白堿性蛋白酶水解液，④代表面筋堿性蛋白酶水解液，⑤代表堿溶蛋白堿性蛋白酶水解液，⑥代表醇溶蛋白堿性蛋白酶水解液。麥芽糖以M表示，葡萄糖以P表示，蔗糖以Z表示。18種發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計如下：①+M、①+P、①+Z、②+M、②+P、②+Z、③+M、③+P、③+Z、④+M、④+P、④+Z、⑤+M、⑤+P、⑤+Z、⑥+M、⑥+P、⑥+Z。

1.3.2 液體培養(yǎng)基的滅菌與接種培養(yǎng)

將3%碳源、1%氮源、100 mL水加入三角瓶中，用紗布、牛皮紙封口，放入蒸汽高壓滅菌鍋，121℃滅菌20min，滅菌后冷卻至室溫。將分離純化后的不同紅曲霉菌株接種到液體培養(yǎng)基中，置于搖床中，32℃、180r/min條件下培養(yǎng)48h。

1.3.3 吸光度測定與含量計算

將經(jīng)過48 h發(fā)酵后的紅曲霉發(fā)酵液逐一進行離心，分別取上清液，用分光光度計在波長490nm處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算其色素產(chǎn)量。

1.3.4 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；掃描方式為負離子掃描；霧化氣壓力為80 kPa；毛細管電壓3.5 kV，干燥氣溫度180℃，干燥氣流速6.0 L/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 10株紅曲霉在18種培養(yǎng)基發(fā)酵液的紅曲色素含量

圖1為紅曲色素標準曲線。發(fā)酵液中的紅曲色素含量由紅曲色素標準液曲線計算得出，結(jié)果見表1。

圖1 紅曲紅的標準曲線Fig.1 Standard curve of Monascus red

表1 紅曲霉菌種發(fā)酵產(chǎn)色素量Table 1 Production of Monascus pigments from Monascus strains fermentation mg/100 mL

從表1中10株紅曲霉對應(yīng)的各種培養(yǎng)基發(fā)酵液中紅曲色素產(chǎn)量可看出，紅曲霉ZBX（8）在各培養(yǎng)基的最高紅曲色素產(chǎn)量值為7.27×10-2mg/mL，對應(yīng)培養(yǎng)基為②大豆分離蛋白+M麥芽糖培養(yǎng)基，而另外9株紅曲霉中除了連天津紅曲霉外，其他8株菌紅曲色素產(chǎn)量最高的均集中在①蛋白胨+P葡萄糖培養(yǎng)基，紅曲色素產(chǎn)量最高為6.81×10-2mg/mL，故最佳培養(yǎng)基為蛋白胨＋葡萄糖培養(yǎng)基。相比較而言，ZBX新疆的紅曲色素在各培養(yǎng)基的最低產(chǎn)量較其他菌株高，連天津的紅曲色素產(chǎn)量較低，分離自北京腐乳中的菌株紅曲色素產(chǎn)量并不相似，廣東腐乳中分離出的菌株紅曲色素產(chǎn)量較東北腐乳中分離的菌株紅曲色素產(chǎn)量要高。各菌株具體的紅曲色素產(chǎn)量范圍見表2。

表2 紅曲霉的色素產(chǎn)量范圍Table 2 Yield range of Monascus pigments mg/100 mL

由表2可知，新疆紅曲霉的紅色素產(chǎn)量最高，其范圍為2.04×10-2～6.81×10-2mg/mL，并且其紅色素產(chǎn)量達到最大值6.81×10-2mg/100 mL時所對應(yīng)的培養(yǎng)基有11種，比較而言，新疆紅曲霉為產(chǎn)紅曲色素的最佳菌種。連天津紅曲色素產(chǎn)量最低，其濃度范圍0.35×10-2～5.79×10-2mg/100 mL。

2.2 10株紅曲霉所對應(yīng)的培養(yǎng)基發(fā)酵液中桔霉素質(zhì)譜圖分析

若發(fā)酵液含有桔霉素，則質(zhì)譜圖中出現(xiàn)的質(zhì)核心（m/z）為249或251。紅曲霉ZBX新疆在④+P培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液質(zhì)譜圖分析結(jié)果見圖2（代表性質(zhì)譜圖），含有桔霉素的紅曲霉及其對應(yīng)的發(fā)酵液培養(yǎng)基如表3所示。

圖2 紅曲霉ZBX新疆在面筋堿性蛋白水解液和葡萄糖發(fā)酵液的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrogram of Monascus ZBX-Xinjiang at hydrolytic solution of gluten alkaline protease and glucose fermentation liquid

由表3可知，新疆地區(qū)紅曲霉只有在培養(yǎng)基為④+P的發(fā)酵液中出現(xiàn)了桔霉素，約為0.7×104ng/mL，該地區(qū)紅曲霉在其余的發(fā)酵液中均無桔霉素檢出；對于實驗所涉及的所有發(fā)酵液來說，培養(yǎng)基為①+Z、②+Z、④+Z、⑤+M、⑤+Z、⑥+M、⑥+Z這7種發(fā)酵液中均無桔霉素；而紅曲霉ZBX天津的所有發(fā)酵液中均未檢測出桔霉素。3結(jié)論

表3 產(chǎn)桔霉素的紅曲霉及其對應(yīng)的發(fā)酵液培養(yǎng)基Table 3 Monascus strains with citrinin production and their corresponding fermentation medium

通過以上實驗分析得出，在研究的多地區(qū)10株紅曲霉及其對應(yīng)的18種液體培養(yǎng)液中，紅曲霉產(chǎn)色素量與紅曲霉菌種和液體培養(yǎng)基組成有重要關(guān)聯(lián)。在10株紅曲霉菌種中，紅曲霉ZBX（8）僅在②大豆分離蛋白+M麥芽糖培養(yǎng)基中紅曲色素產(chǎn)量最高，為7.27×10-2mg/mL，新疆地區(qū)紅曲霉的紅色素產(chǎn)量達到最大值6.81×10-2mg/100 mL時所對應(yīng)的培養(yǎng)基有11種；除了連天津紅曲霉和ZBX（8）紅曲霉，其余8株紅曲霉色素產(chǎn)量最高的一組均集中在①蛋白胨+P葡萄糖培養(yǎng)基，紅曲色素產(chǎn)量為6.81×10-2mg/mL；通過質(zhì)譜分析，新疆地區(qū)紅曲霉在18種液體培養(yǎng)基中僅在④面筋堿性蛋白酶水解液+P葡萄糖的發(fā)酵液中產(chǎn)生桔霉素，其余培養(yǎng)液中均無桔霉素產(chǎn)生，紅曲霉ZBX天津的所有發(fā)酵液中均未產(chǎn)生桔霉素。綜上所述，紅曲霉ZBX天津安全性最強，而新疆地區(qū)紅曲霉比其他地區(qū)紅曲霉菌種產(chǎn)色素能力強。