面包酵母FX-2酶聯輔助自溶工藝研究

許超群，李 嘯，*，程 奔，黃 聰，張小龍，葉 晗

（1.三峽大學 生物與制藥學院，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

酵母自溶（yeast autolysis）是指酵母細胞在特定條件下，經蛋白酶、核酸酶、脂類酶等內源酶（系）將自身內容物降解并釋放的過程。友好條件下的酵母自溶是安全、穩定和高效獲得優質酵母溶出物（俗稱酵母抽提物）的方式。

目前，國內外對酵母“自溶”的研究主要集中在添加非極性有機溶劑、酸堿和無機鹽等[1-4]，通過改變細胞膜通透性加速其胞內物質浸出。此類研究成果被廣泛應用于酵母抽提物工業化生產[5-8]，一方面有微生物污染的風險，另一方面，引入的高濃度離子會對亞健康人群造成較大危害[9]。據報道，通過高壓均質[10]和脈沖電場作用[11]破壞酵母細胞壁和細胞膜結構，加速酵母胞內物質溶出，雖然沒有外物污染風險，但大量細胞碎片難于高效分離，此類研究成果較難產業化。酵母抽提物現已作為第三代天然調味料應用于食品工業，對其品質提出了“綠色無公害”的要求[12]。經統計，國際和國內市場酵母抽提物的總需求量分別為26萬t和6萬t左右，且生產原料基本以面包酵母為主。但由于面包酵母內源性自溶酶（系）較為復雜，對其作用機制認知不夠，未能充分發揮內源酶（系）作用，導致自溶收率難以提高[13]，細胞內殘留物質多。有研究報道，添加外源酶（如木瓜蛋白酶，β-葡聚糖酶和溶菌酶）可以顯著增加酵母細胞中大分子營養物質的生物降解，加速自溶，并獲得理想的實驗結果。酵母抽提物實現安全清潔制造的關鍵就是自溶及酶解，故對面包酵母進行酶聯輔助自溶工藝的研究具有非常重要的現實意義。

本研究主要考察了添加甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、β-葡聚糖酶對面包酵母（Saccharomycescerevisiae）FX-2輔助自溶過程的影響，應用正交試驗設計確定各酶的最佳助溶條件，并進一步比較驗證單酶、雙酶和多酶聯用的助溶能力，獲得條件較為友好的面包酵母酶法輔助自溶工藝，為酵母抽提物的綠色高效開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面包酵母（Saccharomycescerevisiae）FX-2（CCTCCNo：M2016418）、甘露聚糖酶（有效范圍50～55℃、pH4.5～6.0，5萬 U/g）、β-葡聚糖酶（有效范圍50～55 ℃、pH 5.0～6.5，5萬U/g）：安琪酵母股份有限公司；木瓜蛋白酶（有效范圍50～60 ℃、pH5.0～7.0，10萬 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；蝸牛酶（有效范圍30～40℃、pH5.8～7.2，對酵母細胞壁的溶解活性：每1μg的酶2 h內30℃水浴中可有效降解1.28×106個酵母）：上海鼓臣生物技術有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HH-S4型數字恒溫水浴鍋：金壇市城西春蘭實驗儀器廠；TDL-60B型飛鴿牌系列離心機：上海安亭科學儀器廠制造；AL204-IC型電子天平、FE20型pH計：瑞士METTLER TOLEDO公司；MA45型水分快速測定儀：黑龍江龍澤科技發展有限公司；XSP-2C型光學顯微鏡：上海長方光學儀器有限公司；KDN-103F型凱氏自動定氮儀：上海纖檢儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 面包酵母FX-2酶法助溶單一對照試驗

配制干物質含量為13%的酵母乳，測定其pH，分別添加甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、β-葡聚糖酶、蝸牛酶，在各酶的有效作用范圍內于恒溫水浴鍋中進行面包酵母酶法助溶處理，每2 h取樣一次，測定自溶酵母乳離心上清液干物質含量及細胞死亡率。

1.3.2 分析檢測

細胞死亡率測定：取稀釋一定濃度的自溶酵母乳0.1mL，滴加次甲基藍染液0.9 mL，染色10 min，用血球計數板計數，無色（A）為活菌，藍色（B）為死菌，計算細胞死亡率，其計算公式如下：

自溶酵母乳離心上清液干物質含量測定：取15 mL酵母乳，于5 000 r/min離心10 min，稱取5.1～6.9 g上清液，于水分快速測定儀上測定水分含量，從而計算干物質含量。酵母細胞壁葡聚糖和甘露聚糖含量測定采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[14]，總氮和氨基酸態氮含量測定分別采用微量凱氏定氮法和甲醛滴定法[15]。

1.3.3 面包酵母FX-2輔助自溶條件確定單因素試驗

13%酵母乳于不同條件下進行酶法助溶處理12 h，以細胞死亡率及離心上清液干物質含量為評價指標，分別考察酶添加量、pH、溫度對各酶（甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶）輔助酵母自溶過程的影響。

1.3.4 正交試驗

根據單因素試驗結果，選取酶添加量、pH、溫度3個對面包酵母輔助自溶過程影響較大的因素，以細胞死亡率為評價指標，選用L9（33）正交試驗設計，優化各酶輔助酵母自溶的條件，試驗因素與水平見表1。

表1 酶輔助自溶條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzyme assisted-autolysis conditions optimization

1.3.5 單酶、雙酶和多酶聯用助溶能力比較

在正交試驗結果基礎上，以細胞死亡率和離心上清液干物質含量為評價指標，同時檢測細胞壁氨基酸態氮、總氮、葡聚糖和甘露聚糖等成分的含量，比較并驗證單酶、雙酶和三酶聯用的助溶能力。其中雙酶和多酶聯用助溶過程中，加酶順序按酵母細胞壁由外到內的組分相對應的水解酶種類進行，加酶時間間隔為30 min，具體方案見表2。

表2 助溶能力驗證實驗方案設計Table 2 Validation experiments design for assisted-autolysis ability

2 結果與分析

2.1 面包酵母FX-2酶法助溶單一對照試驗結果

不同酶在各自有效作用條件下[甘露聚糖酶（52.5℃、pH 6.0）、木瓜蛋白酶（52.5℃、pH6.0）、β-葡聚糖酶（52.5℃、pH6.0）和蝸牛酶（37℃、pH6.0）]，輔助酵母自溶的效果，結果見圖1。

圖1 不同酶對面包酵母FX-2輔助自溶效果的影響Fig.1 Effect of different enzymes on the assisted-autolysis performance of baker's yeast FX-2

由圖1可知，甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、β-葡聚糖酶在面包酵母輔助自溶過程中均有明顯的作用效果，其中木瓜蛋白酶效果最為顯著（圖1B），與空白組相比，加酶組酵母乳離心上清液干物質含量較高，且細胞死亡速率明顯加快。甘露聚糖酶（圖1A）和β-葡聚糖酶（圖1C）分別在6 h和10 h左右開始加速酵母自溶，體現在加酶組細胞死亡率和離心上清液干物質含量的提高，其中β-葡聚糖酶發揮作用的時間相比較晚，可能是由于前期酵母細胞壁完整，β-葡聚糖酶較難作用于細胞壁葡聚糖內層造成的。相反，蝸牛酶作用效果較小（圖1D），在連續自溶24 h的過程中，與空白組相比，加酶組細胞死亡率和離心上清液干物質含量均無明顯提升，這可能是由于酵母細胞在蝸牛酶的作用環境中（37℃），溫度壓力小，仍具有較高活性，加之酵母特有的堅固細胞壁結構，使其在友好溫度下具有較強的應激抗性。結合上述實驗結果分析，可知酵母輔助自溶過程不僅受外加酶種類的影響，還在很大程度上受溫度的影響。基于此，選擇效果較為明顯的甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶做進一步研究。

2.2 面包酵母FX-2輔助自溶條件確定單因素試驗結果

2.2.1 甘露聚糖酶助溶單因素試驗結果

在甘露聚糖酶的有效作用條件（即pH5.5，溫度52.5℃）下，研究了酶添加量對酵母輔助自溶效果的影響見圖2A，由圖2A可知，酶添加量為0.6‰時，細胞死亡率相對較高，效果較好；在酶添加量為0.6‰，溫度52.5℃的條件下，研究了pH對助溶效果的影響見圖2B，由圖2B可知，pH5.5時，細胞死亡率及酵母乳離心上清液干物質含量均較高，表明該pH條件更有利甘露聚糖酶輔助酵母自溶，而pH較低時（＜5.0），助溶效果差，這可能是由于甘露聚糖酶的活性受到了部分抑制；在酶添加量為0.6‰，pH5.5的條件下，研究了溫度助溶效果的影響見圖2C，由圖2C可知，隨溫度的上升，助溶程度不斷提高，這可能是由于溫度越高，酵母細胞所受的環境壓力也越大，其自身壓力應激反應會激活胞內相關自溶酶（系），加速細胞瓦解[1]。而當溫度＞55.0℃時，助溶程度放緩，這可能是由于溫度較高，抑制了酶的活性，導致細胞壁甘露聚糖層的水解過程受到影響，因此選擇55.0℃為最適溫度。

圖2 不同因素對甘露聚糖酶輔助面包酵母自溶效果的影響Fig.2 Effects of different factors on the mannase assisted-autolysis performance of baker's yeast

2.2.2 木瓜蛋白酶助溶單因素試驗結果

在木瓜蛋白酶有效作用范圍內，選擇pH5.5，溫度52.5℃為初始條件，考察了酶添加量對酵母酶法助溶效果的影響見圖3A，由圖3A可知，在酶添加量為0.4‰時，細胞死亡率達到最大值，酶添加量＞0.4‰時，離心液干物質含量雖有較小幅度提升但變化不大且較為穩定，因此選擇0.4‰為最適酶添加量；在酶添加量為0.4‰，溫度52.5℃的條件下，不同pH值對助溶效果的影響見圖3B，由圖3B可知，pH5.5時，細胞死亡率及離心上清液干物質含量同時達到最高水平，表明該pH條件更有利木瓜蛋白酶的輔助酵母自溶過程，而pH值較低或較高時，助溶效果較差；在最適酶添加量0.4‰、最適pH5.5的條件下，研究了溫度對酵母助溶過程的影響見圖3C，從圖3C可知，隨溫度的升高，酵母助溶程度也不斷提高，當溫度達到55.0℃時，酵母細胞基本全部死亡（細胞死亡率＞95%），進一步說明酵母細胞響應高溫壓力會加速自身降解，隨著溫度的進一步升高，自溶酵母乳離心上清液干物質含量仍不斷提高，這是由于酵母死亡后，較高的溫度會加速細胞瓦解，如破壞細胞壁結構，造成壁孔，加速胞內物質逸出[11]，但高溫劇烈條件，會影響酵母內源自溶酶（系）的作用，抑制部分木瓜蛋白酶的水解活性，并且加大能耗，因此選擇最適溫度為55.0℃。

圖3 不同因素對木瓜蛋白酶輔助面包酵母自溶效果的影響Fig.3 Effects of different factors on the papain assisted-autolysis performance of baker's yeast

2.2.3 β-葡聚糖酶助溶單因素試驗結果

在β-葡聚糖酶的有效作用范圍內，選擇pH5.5，溫度52.5℃為初始條件，考察了酶添加量對酵母助溶效果的影響見圖4A，由圖4A可知，酶添加量為0.2‰時，細胞死亡率和離心液干物質含量均相對較高，助溶效果較好；在酶添加量為0.2‰，溫度52.5℃的條件下，不同pH值對助溶效果的影響見圖4B，由圖4B可知，當pH＞6.0時，助溶程度明顯較低，說明該pH條件不利酵母自身內源水解酶（系）及外源β-葡聚糖酶發揮作用，考慮到自然酵母乳一般呈偏酸性（pH＜6.0），選擇pH 5.5為最適條件；在酶添加量0.2‰，pH 5.5的條件下，研究了溫度對酵母助溶過程的影響見圖4C，由圖4C可知，隨溫度的上升，自溶酵母乳離心上清液干物質含量不斷提高，但細胞死亡率在溫度＞52.5℃時呈現出下降趨勢，在57.5℃時又出現回升，這充分說明較高的溫度（＞52.5℃）會影響β-葡聚糖酶的活性，減緩酵母細胞壁水解過程，降低細胞死亡率，而當溫度過高時（＞57.5℃），酵母細胞難以耐受環境條件，加速自身瓦解，釋放胞內物質。綜合考慮，選擇52.5℃為最適溫度。

圖4 不同因素對β-葡聚糖酶輔助面包酵母自溶效果的影響Fig.4 Effects of different factors on theβ-glucanase assisted-autolysis performance of baker's yeast

2.3 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，以細胞死亡率為評價指標，分別按照表1、表2和表3的設計進行了甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶輔助酵母自溶條件的進一步優化，正交試驗結果與分析如表3～表5所示。

由表3可知，甘露聚糖酶助溶條件對面包酵母死亡率（酶法輔助自溶效率）的影響順序為C（溫度）＞B（pH）＞A（酶添加量），細胞死亡率最高的條件組合是A2B3C2，即酶添加量0.6‰，pH 6.0，溫度55.0℃。在此最佳條件下助溶12 h，細胞死亡率為98.26%，同時酵母乳離心上清液干物質含量達5.47%。由表4可知，木瓜蛋白酶助溶條件對細胞死亡率的影響順序為C（溫度）＞B（pH）＞A（酶添加量），細胞死亡率最高的條件組合是A3B2C3，即酶添加量0.6‰，pH 5.5，溫度57.5℃。在此最佳條件下4進行驗證試驗，細胞死亡率為100%，同時酵母乳離心上清液干物質含量達9.21%。由表5可知，β-葡聚糖酶助溶條件對細胞死亡率的影響順序為C（溫度）＞A（酶添加量）＞B（pH），細胞死亡率最高的條件組合是A2B3C3，即β-葡聚糖酶添加量0.2‰，pH 6.0，溫度55.0℃。在此最佳條件下，進行驗證試驗，細胞死亡率為97.92%，同時酵母乳離心上清液干物質含量達5.18%。結果表明，木瓜蛋白助溶效果最好，其次是甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶。

表3 甘露聚糖酶輔助自溶條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for mannanase assisted-autolysis conditions optimization

表4 木瓜蛋白酶輔助自溶條件優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for papain assisted-autolysis conditions optimization

表5 β-葡聚糖酶輔助自溶條件優化正交試驗結果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for β-glucanase assisted-autolysis conditions optimization

2.4 單酶、雙酶和多酶聯用助溶能力比較驗證實驗結果

基于正交試驗的優化結果，按照表4設計實驗，助溶10h（單酶助溶12 h，各方案下酵母細胞死亡率分別為98.26%，100%和97.92%，即接近全部死亡或全部死亡。基于多酶聯用優于單酶作用效果，可以縮短助溶時間，選擇10 h為評判終點，進一步優化助溶工藝），測定細胞死亡率及酵母乳離心干物質含量，比較不同單酶及復合酶對酵母助溶過程的作用效果，結果見圖5。

圖5 各方案輔助自溶效果比較Fig.5 Comparison of assisted-autolysis performance of different scheme

由圖5可知，在單酶作用方案中，木瓜蛋白酶（c）的作用效果最好，其次是甘露聚糖酶（a）和β-葡聚糖酶（b），這與正交試驗的結果基本相符。從細胞死亡率和酵母乳離心上清液干物質含量的高低水平來看，雙酶（d、e、f）和多酶聯用（g）方案的助溶效果均優于單酶方案。在雙酶方案中，木瓜蛋白酶＋β-葡聚糖酶（e）效果最好，其次是甘露聚糖酶＋木瓜蛋白酶（f）和甘露聚糖酶＋β-葡聚糖酶（d）。甘露聚糖酶＋木瓜蛋白酶＋β-葡聚糖酶的三酶聯用方案（g）助溶效果基本與e方案相當，表現在兩方案的細胞死亡率均達到100%，其中e方案的離心液干物質含量稍高于g方案。因此，選擇雙酶組合e為最優方案，即13%酵母乳調pH至5.5，添加0.6‰木瓜蛋白酶，于57.5℃助溶30 min后，調節溫度為55 ℃、pH為 6.0、添加0.2‰β-葡聚糖酶，助溶至10 h。該條件下，細胞死亡率及酵母乳離心上清液干物質含量分別達100%和9.40%。

為驗證優化方案的可靠性，收集各助溶方案下的酵母細胞壁檢測相關指標，結果見圖6和表6。

圖6 面包酵母輔助自溶細胞壁檢測數據Fig.6 The cell wall detection data of baker's yeast after assisted-autolysis

表6 面包酵母輔助自溶細胞壁各組分含量變化Table 6 Content changes of cell wall components in baker's yeast assisted-autolysis%

由圖6和表8可知，方案e條件下，酵母細胞壁總氮、葡聚糖及甘露聚糖含量均較低，表明該方案下，細胞壁水解相對充分，其水解度高達54.41%，酵母自溶率理想；而氨氮含量為1.45%，相對較高，進一步說明酵母細胞壁蛋白質層水解嚴重，酵母溶解程度提高，這與圖5中結果相符，驗證了方案e的可靠性。

3 結論

本項目主要研究了外源酶添加對面包酵母（Saccharomycescerevisiae）FX-2輔助自溶過程的影響。通過單因素試驗和正交試驗確定不同外源酶輔助酵母自溶效率最高的條件，效果最好的為木瓜蛋白酶：酶添加量為0.6‰，pH 5.5，助溶溫度57.5℃。該條件下，助溶12 h，細胞死亡率達100%，同時酵母乳離心上清液干物質含量也高達9.21%。在此基礎上，進一步研究了單酶、雙酶和多酶聯用的助溶能力，獲得條件友好的面包酵母酶法助溶工藝：13%酵母乳調pH至5.5，添加0.6‰木瓜蛋白酶，于57.5℃條件下助溶30min后，調節溫度為55℃、pH為6.0、添加0.2‰β-葡聚糖酶，助溶至10 h。該工藝下，細胞死亡率及離心上清液干物質含量分別為100%和9.40%，同時細胞壁水解程度高達54.41%，進一步優化了面包酵母酶法助溶過程，縮短助溶時間。

本研究開發的面包酵母FX-2酶法助溶工藝，操作簡單，條件溫和，助溶效率高，對酵母自溶工藝的優化及高品質酵母抽提物的生產具有一定的指導意義，且應用前景良好。