乳糖利用酵母菌的篩選及其特性初步研究

（北方民族大學生物科學與工程學院/寧夏特殊生境微生物資源開發與利用重點實驗室/國家民委發酵釀造工程生物技術重點實驗室，寧夏銀川750021）

乳糖是一種由一分子葡萄糖和一分子半乳糖經β-1，4-糖苷鍵縮合而成的雙糖，它是哺乳動物乳汁中一種重要的碳水化合物。牛乳中乳糖平均含量為4.8%，約占牛乳總能量的30%，人乳中乳糖平均含量達7.0%，是新生兒主要的能量來源[1]。乳糖不能被人體直接吸收利用，必需在小腸內通過乳糖酶水解為葡萄糖和半乳糖而被吸收。然而，諸多因素，如種族、年齡、遺傳、疾病等會導致相當一部分人體內乳糖酶活性下降，引起乳糖消化不良，飲用牛乳后出現胃腸道反應，如腹脹、腸痙攣、腸鳴及腹瀉等[2-3]。乳糖不耐癥是指與乳糖消化不良相關的胃腸道癥狀[1]，其發生率在亞洲為 80%～100%，非洲為70%～75%，美國為15%～80%，歐洲總體為15%～70%[4]。中國人群乳糖酶缺乏發生率達75%～95.5%[5]。為適應該部分人的體質，很多企業將乳制品中的乳糖分解，制成低乳糖奶或無乳糖奶。根據《食品營養聲稱和營養成分功能聲稱準則》，乳糖含量≤2 g/100 g（mL）的可成為低乳糖，乳糖含量≤0.5 g/100 g（mL）的可稱作無乳糖。

目前，生產低乳糖牛奶最安全、有效和實用的方法是向牛奶和乳制品中添加外源性半乳糖苷酶或葡萄糖苷酶，將乳糖水解成易于人體吸收的單糖[6-7]。目前廣泛應用于工業化生產的乳糖酶來自于真菌，如曲霉屬真菌（Aspergillus sp.）和酵母菌中的克魯維酵母菌屬（Kluyveromyces sp.），前者的最適活性pH值為酸性（pH 4.8），所以更適合于水解酸性食品如乳清中的乳糖，后者的最適pH值接近于中性（pH 6.0～7.0），故更多用于牛奶中乳糖的水解[8]。有些酵母菌在生長過程中能產生香味物質，這類酵母菌被稱為生香酵母[9]。目前已報道的能產生香氣的酵母菌主要包括畢赤酵母、球擬酵母、假絲酵母和漢遜酵母等[10-12]。因其獨特的風味貢獻，生香酵母已成功應用于白酒、醬油、食醋等行業[13-15]。具有乳糖利用能力或具有產香功能的酵母菌種類均較多，然而即能利用乳糖，又可產生香氣的酵母種類并不多。本文擬通過富集、分離、純化從水果外表皮和生牛奶中選出即可高效、穩定利用乳糖，又可產生香氣的酵母菌，并對其利用特征進行初步研究，以期為生產低乳糖并具獨特香味的純牛奶提供酵母菌資源和初步的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用水果（香蕉、蘋果、山楂）及生牛奶：市售；葡萄糖、乳糖、酵母提取粉、蛋白胨、瓊脂粉（均為生物試劑純）：北京奧博星生物技術有限責任公司；95%乙醇、（NH4）2SO4、NaOH、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O（均為分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；KOH、Ba（OH）2、ZnSO4、NaHSO3、Na2HPO4（均為分析純）：天津市北聯精細化學品開發有限公司；甲基藍（分析純）：上海泰坦科技股份有限公司；苯酚、苦味酸（分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.1.1 試劑配制

0.1%美藍染液：甲基藍0.3 g溶于30 mL 95%的乙醇，再與100 mL 0.01%的KOH溶液混合。

除蛋白試劑：4.5%Ba（OH）2和 5%ZnSO4溶液。

終止試劑：1.0%苯酚：5.0%NaOH：1.0%苦味酸（2，4，6-三硝基酚）：1.0%NaHSO3=1∶2∶2∶1（體積比），貯存于棕色試劑瓶中，置于4℃冰箱中（一周內使用）[16]。

1.1.2 培養基配制

酵母富集培養基：0.1%（NH4）2SO4，0.25%KH2PO4，0.1%MgSO4·7H2O，0.1%FeSO4·7H2O，5%葡萄糖，0.05%酵母提取粉，0.05%Na2HPO4。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培養基：1%酵母提取粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉。

乳糖培養基：2%乳糖，1%酵母提取粉，2%蛋白胨，2%瓊脂粉。

1.1.3 主要儀器與設備

UV 1000紫外可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；TGL 18M臺式高速冷凍離心機：湖南湘立科學儀器有限公司；LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；LRH-150生化培養箱：上海一恒科技有限公司；THZ-9511K雙層恒溫振蕩器：蘇州培英實驗設備有限公司；SN-CJ-2F超凈化工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 酵母菌的分離

1.2.1 生牛奶中酵母菌的分離

取1mL生牛奶于100mL酵母富集培養基中，30℃、100 r/min搖床培養48 h，將培養液用0.9%的NaCl溶液進行梯度稀釋，取0.1 mL涂布至YPD平板，30℃培養2 d，挑取單菌落劃線純化5次。

1.2.2 水果表面酵母菌的分離

取新鮮香蕉、蘋果、山楂的外表皮各2 g，加至100 mL酵母富集培養基中，30℃、100 r/min搖床培養48 h，取培養液進行稀釋涂布，方法同1.2.1。

1.2.3 可利用乳糖酵母菌的篩選

采用劃線法將已純化好的酵母菌株接至乳糖培養基上，篩選出具有乳糖利用能力的菌株。

1.3 酵母菌株生長曲線的測定

將純化好的代表菌株用液體YPD培養基活化16 h做成種子液，用移液槍吸取1 mL種子液于裝有100 mL乳糖液體培養基的三角瓶里，30℃，100 r/min搖床培養，每隔2小時取樣測定OD600nm，以空白液體培養基為對照。每個樣測定3次取平均值，共測36 h。以時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標作出生長曲線。

1.4 酵母菌對乳糖利用能力分析

取適量斜面活化的酵母菌種接種于液體YPD培養基中，于30℃、100 r/min振蕩培養12 h。按10%的接種量將培養液接種到100 mL已滅菌的牛奶中，30℃、100 r/min振蕩培養48 h，測定牛奶中乳糖含量。

1.5 不同菌株最佳處理時間分析

按照1.4中的方法準備酵母菌培養液，按10%的接種量將培養液接種到100 mL已滅菌的牛奶中，30℃，100 r/min振蕩培養，于不同時間取樣分析牛奶中乳糖含量，以確定不同菌株對乳糖處理的最佳時間。

1.6 酵母菌不同接種量對乳糖利用效果的影響

按照1.4中的方法準備酵母菌培養液，分別按4%、6%和8%的接種量將培養液接種到100 mL已滅菌的牛奶中，30℃，100 r/min振蕩培養，培養時間根據1.5中所確定的最佳處理時間來確定，培養結束后分析酵母菌不同接種量對乳糖利用效果的影響。

1.7 乳糖含量的測定

1.7.1 乳糖含量標準曲線的測定

分別吸取乳糖標準溶液 0、25、50、75、100、150、200 μL（相當于 0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 mg的乳糖）于15 mL離心管中，分別加入0.2 mL 5.0%的ZnSO4溶液和 0.2 mL 4.5%Ba（OH）2溶液，定容至 5 mL，混合均勻后于1 200 r/min離心1 min，吸取1.0 mL上清液加入比色管中，然后加入2.5 mL的終止試劑，蓋緊塞子，將此管浸入沸水中4 cm～6 cm，加熱煮沸6分鐘后立即于冰水中冷卻，加蒸餾水定容至10 mL，上下顛倒幾次混勻，測定OD520nm。以乳糖含量為橫坐標，OD520nm值為縱坐標制作標準曲線。

1.7.2 樣品中乳糖含量的測定

取2.0 mL用酵母菌處理過的牛奶于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。混勻后，取2.5 mL于15 mL離心管中，再依次加入0.2 mL 5%的ZnSO4溶液和0.2 mL 4.5%的Ba（OH）2溶液，晃動使其反應，用蒸餾水定容至5 mL，搖勻，以1 200 r/min離心1 min。將1.0 mL透明上清液轉移至新的15 mL離心管中，加入2.5 mL終止試劑，擰緊蓋子。浸泡離心管的底部4 cm～6 cm，置于沸水浴中6分鐘后立即在冷水中冷卻2 min～3 min。用蒸餾水定容至10 mL，上下顛倒5次后測定OD520nm，帶入標準曲線，計算乳糖含量。

1.8 酵母菌處理后對牛奶風味的影響

取適量斜面活化的酵母菌種接種于液體YPD培養基中，于30℃，100 r/min振蕩培養12 h。根據1.6中所確定的接種量將培養液接種到100 mL已滅菌的牛奶中，30℃、100 r/min振蕩培養，培養時間根據1.5中所確定的最佳處理時間來確定。處理結束后，根據感官評定不同菌株處理后牛奶的風味。本次試驗共邀請10位食品專業師生進行評價，其中6位學生，4位老師。感官評定采用5分制，分值越高，表明該特征指標越好。品評人員須對牛奶的香味、腥味以及整體風味分別進行打分，各項特征描述見表1[16-17]。

1.9 酵母菌的鑒定

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[18]對所篩選酵母菌株進行初步鑒定，結合18S rRNA序列測定，將序列信息輸入美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）（www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫進行比對分析，根據同源性比對結果鑒定到屬。構建系統發育樹分析其進化地位，發育樹根據鄰位法建立，所取bootstraps值為1 000，Kodamaea ohmeri CBS 1950T為外源菌株，括號中的數字為微生物菌株在基因庫中的登錄號。

表1 酵母菌處理后牛奶感官評定分值表Table 1 Sensory evaluation score table of milk after treatment of yeast strains

2 結果與分析

2.1 酵母菌的篩選及其對乳糖的利用能力

經分離、純化共得到10株酵母菌。其中，從牛奶中分離純化得到的4株酵母菌，編號為M1～M4；從蘋果表皮分離純化得到的2株酵母菌，編號為A1、A2；從香蕉表皮分離純化得到的2株酵母菌，編號為B1、B2；從山楂表皮分離純化得到的2株酵母菌，編號為H1、H2。各酵母菌株對牛奶中乳糖的利用能力如圖1所示。

圖1 酵母菌對乳糖的利用能力Fig.1 The lactose use ability of different yeast strains

加入10%的酵母菌液，經過48 h的降解，10株酵母菌所處理的牛奶中乳糖含量均有明顯的下降趨勢。相比較而言，菌株B1、B2、H1和H2對乳糖的利用效果最為明顯，使牛奶中乳糖含量從5%左右降至2.5%左右，故后續試驗選用這4株酵母菌作為試驗菌株。

2.2 酵母菌生長曲線

對酵母菌株B1、B2、H1和H2的生長曲線進行了測定，如圖2所示。

圖2 酵母菌株生長曲線Fig.2 The growth curves of yeast strains

可以看出，在30℃的條件下，36 h之內，4株酵母菌基本體現出細胞生長的4個階段：調整期、對數期、穩定期和衰亡期，4株菌大體在20 h～26 h生長量達到最大。

2.3 酵母菌株最佳處理時間分析

根據酵母菌株B1、B2、H1和H2的生長曲線，分別測定了其在20、26、36 h對牛奶中乳糖的利用效果，如圖3所示。

圖3 不同酵母菌處理過程中乳糖含量隨時間變化Fig.3 Changes of lactose content with time during the treatment of different yeast strains

在接種量相同（10%）的情況下，4株酵母菌26 h后可將牛奶中的乳糖將至2.5%左右，接近于低乳糖牛奶中乳糖含量標準。36 h的處理效果與26 h沒有顯著性差異，故后續試驗選用的處理時間為26 h。

2.4 酵母菌不同接種量對乳糖利用效果的影響

在相同時間（26 h）下，酵母菌不同接種量對牛奶中乳糖處理效果的影響如圖4所示。

圖4 酵母菌不同接種量對乳糖利用效果的影響Fig.4 Effects of different inoculum size on the efficiency of lactose use

可以看出，對于B1，接種量為4%時，26小時后可將乳糖含量降至3.1%，當接種量提高到6%時，乳糖含量明顯下降，26 h后降至2.8%，但當繼續提高接種量時，其對乳糖利用能力沒有顯著提升。對于B2、H1和H2，當接種量提高到8%時，26小時后可將乳糖含量分別降至2.7%、2.5%和2.8%，明顯高于4%和6%的接種量，但與10%的接種量沒有顯著性差異。因此，菌株B1的最佳接種量為6%，B2、H1和H2的最佳接種量均為8%。

2.5 酵母菌處理后純牛奶的氣味評價

對酵母菌B1、B2、H1和H2處理后的純牛奶氣味進行了初步的感官評定，結果如圖5所示。

圖5 酵母菌處理后牛奶感官特征評分結果Fig.5 Sensory evaluation on the odor of milk after treatment of yeast strains

與不經酵母菌處理的純牛奶相比，各菌株處理后的牛奶均增添了不同程度的香味，無腥味、無異味，整體風味均有不同程度的改善。

2.6 菌株鑒定

采用形態觀察法結合18S rRNA基因序列比對的方法對菌株B1、B2、H1和H2進行了鑒定。4株菌在YPD固體培養基上培養時，菌落顏色、形態，細胞形態、大小，以及液體培養形態特征各不相同，如表3和圖6所示。

表3 酵母菌形態特征（3天）Table 3 Physiological characteristics of yeast strains（3 days）

圖5 4株酵母菌的菌落形態和細胞形態（10×40倍）Fig.5 Colonyand cell morphology（10×40 times）of 4 yeast strains

在YPD固體培養基上培養3天后，B1菌落為乳白色，圓形，直徑10 mm～15 mm，中間突起，質地粗糙，邊緣全緣；B2菌落為純白色，橢圓形，直徑10 mm～15 mm，中間突起，質地光滑，邊緣全緣；H1菌落為乳白色，圓形，直徑4 mm～9 mm，中間突起，質地光滑，邊緣全緣；H2菌落為奶油色，圓形，直徑4 mm～9 mm，中間突起，質地光滑，邊緣齒輪。在40倍光學顯微鏡下觀察各菌株細胞形態，B1和B2為圓形，H1和H2為橢圓形，都有出芽，B1和H1有假菌絲。液體培養3天后B1和B2培養液均勻渾濁，H1和H2稍有渾濁，靜置后底部均有沉淀。

將B1、B2、H1和H2的18S rRNA基因序列在基因庫中進行同源性對比，結果見表4。

結果發現，B1與梅奇酵母菌屬（Metschnikowia sp.）多個菌種基因序列同源性達99%B2與威克漢姆酵母菌屬（Wickerhamomyces sp.）多個菌種基因序列同源性達99%，H1與假絲酵母菌屬（Candida sp.）和畢赤酵母菌屬（Meyerozyma sp.）多個菌種基因序列同源性達99%，H2與畢赤酵母菌屬（Meyerozyma sp.）多個菌種基因序列同源性達100%以上，與假絲酵母菌屬（Candida sp.）多個菌種基因序列同源性達99%。通過與基因庫中典型模式菌株序列構建系統發育樹，分析了各菌株的進化地位，如圖5所示。

表4 18S rRNA基因序列對比結果Table 4 Alignment results of 18S rRNA sequences

圖5 基于18S rRNA基因序列的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of 18S rRNA sequences

結果表明，B1與Metschnikowia bicuspidata strain NRRL YB-4993（JQ698902.1）在同一分支，B2 與 Wick erhamomycesanomalusstrainNRRLY-366（EF552565.1）在同一分支，可以確定酵母菌B1為梅奇酵母菌屬（Metschnikowia sp.），B2為威克漢姆酵母菌屬（Wickerhamomyces sp.）。H1 和 H2 與 Meyerozyma caribbica CBS 2022 （KY 104217.1）、Meyerozyma caribbica CBS 9966 （KY 104222.1）、Meyerozyma caribbica CBS 9966（NR 149348.1）在同一分支，所以確定H1和H2均為畢赤酵母菌屬（Meyerozyma sp.）。

3 討論

根據《酵母菌的特征與鑒定手冊》[18]，二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidata）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和奧默畢赤酵母（Pichia ohmeri）均能在乳糖環境下生長。除此之外，白吉利絲孢酵母（Triehosporonbei geli）、赭色擲孢酵母（Sporobolomyces salomonicolor）、異酒香酵母（Brettanomyces anomalus）、海泥克魯維酵母（Kluyveromyces aestuarii）、間型假絲酵母（Candida intermedia）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、尼泊爾德巴利酵母（Debaryomyces nepalensis）、水生絲孢酵母（Aquatic Hyphomycetes）、土生假絲酵母（Candida humicola）、白地霉（Geotrichum candidum）、地生隱球酵母（Cryptococcus terreus）等都能在乳糖環境下生長。

畢赤酵母（Pichia sp./Meyerozyma sp.）、威克酵母（Wickerhamomyces sp.）為典型的產香酵母菌，在許多研究中都有報道。劉陽等[19]從柑橘中篩選得到4株生香酵母，其中兩株分別為畢赤酵母（Pichia sp.1 TMS-2011）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），其最主要的香氣成分均為苯乙醇。而苯乙醇是一種比較典型的芳香醇，具有淡雅細膩的玫瑰香氣，在食品、白酒、果酒、藥品及化妝品等行業中都有著廣泛的應用[20]。劉英麗等[21]從傳統發酵食品中分離篩選到5株產香酵母菌，其中3株為異常威克漢姆酵母菌，經分析它們的麥芽汁發酵液中主要揮發性成分為3-甲基-1-丁醇、2-呋喃甲醇、2-苯基乙醇、2-甲基-1-丙醇和醋酸乙酯。高健等[22]從莖用萵苣中分離出一株異常威克漢姆酵母菌，其在培養時發出淡淡的清香味，經檢測其產生的揮發性成分大多為烯類和醇類兩大類，主要包括檸檬烯、月桂烯、香檜烯、α-蒎烯、羅勒烯、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇和2-辛醇等。王益姝等[9]從酒醅中分離篩選出兩株產獨特香氣的酵母菌，經鑒定為異常威克漢姆酵母菌，分析表明，酯類和醇類是該生香酵母菌發酵液中主體香氣成分，其中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、異戊醇和乙醇是其中相對含量較高的4種風味物質。付俊淑等[23]檢測了12株食品來源酵母菌的揮發性成分，其中1株為喜仙人掌畢赤酵母（Pichia cactophil）、1 株膜噗畢赤酵母（Pichia membranifaciens）、2株Kudriavzevii畢赤酵母，結果表明，酵母發酵后的香氣組分主要為酯類，包括乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯等。吳群等[24]研究了一株產風味的異常威克漢姆酵母菌，其在發酵過程過程中具有產多種酯類物質的特點。關于梅奇酵母菌也有少量關于其產香方面的報道，古其會等[25]從番木瓜酒中分離出一株產香的梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.），由該菌株發酵制成的番木瓜酒香氣濃郁、獨特。

能在乳糖環境下生長的酵母種類較多，產香酵母種類也較多。然而，即能利用降解乳糖，又可產生香氣的酵母種類并不多。本研究所分離出的4株酵母菌分屬于梅奇酵母菌屬（Metschnikowia sp.）、威克漢姆酵母菌屬（Wickerhamomyces sp.）和畢赤酵母菌屬（Meyerozyma sp.），它們即可有效降低牛奶中乳糖含量，又可產生獨特的香氣從而改善牛奶風味，因而在低乳糖牛奶生產中具有較大的應用前景，但其具體揮發性成分還需進一步研究。

4 結論

從水果表皮和生牛奶中篩選出4株對牛奶中乳糖具有良好利用效果的酵母菌，26小時后可將牛奶中的乳糖含量從5%左右降至2.5%左右，接近于國家低乳糖牛奶的標準；4株酵母菌分屬于3個屬，分別為梅奇酵母菌屬（Metschnikowia sp.）、威克漢姆酵母菌屬（Wickerhamomyces sp.）和畢赤酵母菌屬（Meyerozyma sp.），經處理后的牛奶具有不同香氣。研究結果可為生產低乳糖并具獨特香氣的純牛奶提供一定的酵母菌資源和初步的理論依據。