基于二維色譜及其聯用技術篩查乳及乳制品中外源性風險物質的分析方法研究進展

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(1.陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西西安 710021; 2.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100123)

隨著人們對食品安全問題關注度的增高與農業進出口貿易的增長,對于外源性風險物質監控的法規越來越嚴格。以農藥殘留為例,各國設置了不同的農藥殘留限量標準,這些嚴格的標準推動了更快速和更靈敏檢測技術的發展。二維色譜具有峰容量大,分辨率、靈敏度和精確度高等特點,與質譜聯用可對復雜樣品中痕量成分的進行高通量篩查、多殘留分析及精準定量。而乳制品中基質組分數量多,外源性風險物質多為痕量物質,含量極低,且各國標準中對于乳制品中風險物質的殘留限量越來越嚴格,因此開展這方面的研究具有重要的意義。

根據圖1和圖2可知,近些年來,針對二維色譜的研究呈上升趨勢,將其應用在乳及乳制品中外源性風險物質篩查分析方向前景良好。本文綜述了近十年來二維色譜在乳及乳制品中風險物質篩查研究的應用進展,并對其發展趨勢及相關應用前景進行了總結展望。

圖1 Wed of Science數據庫文獻統計情況Fig.1 Web of Science database literature statistics

圖2 中國知網數據庫文獻統計情況Fig.2 CNKI database literature statistics

1 乳與乳制品中外源性風險物質及其篩查分析技術簡介

1.1 乳及乳制品中外源性風險物質概述

歐盟指令2002/657/EC對乳及乳制品中外源性風險物質定義為:在奶牛養殖與乳及乳制品生產、加工、流通過程中引入的物質。從養殖與加工引入的角度,將外源性風險物質分為:食品添加劑與非法添加物、農藥殘留、獸藥殘留、塑化劑和真菌毒素五大類。

1.1.1 食品添加劑與非法添加物 食品添加劑已經成為乳品工業技術進步和科技創新的重要推動力。GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》第2.1條對食品添加劑定義為:食品生產加工過程中為改善產品色、香、味等品質與為抗氧化、防腐、保鮮和加工工藝的需要加入食品中的天然或人工合成物質[1]。我國食品添加劑分為23個類別,其中在乳及乳制品中廣泛應用的是乳化劑、增稠劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑這五種,以提高其理化性質與感官品質。依據GB 14880-2012《食品安全國家標準 食品營養強化劑使用標準》與11個增補公告,在乳制品中添加維生素、礦物質、核苷與核苷酸、不飽和脂肪酸等營養強化劑,起到平衡營養成分與彌補營養素缺失的作用[2]。

非法添加物指超出GB 2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》與GB 14880-2012《食品安全國家標準食品營養強化劑使用標準》(含5個增補公告)規定的使用范圍,以及包括被列入全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治領導小組公布的五批《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單》中的非法食用物質[3]。表1和表2所列為乳及乳制品中可能違法添加的非食用物質和可能濫用的食品添加劑名單[4]。

表1 乳及乳制品中可能違法添加的非食用物質名單Table 1 List of non-food substances that may be illegally added to milk and dairy products

表2 乳及乳制品中可能濫用的食品添加劑品種名單Table 2 Milk and dairy products may abuse the list of food additives varieties

1.1.2 農藥殘留 乳及乳制品中的農藥殘留主要來源于奶牛在飼養過程中,食用含有農藥殘留的飼料或飲用被污染的水源,經過食物鏈蓄積于人體;為抑制奶牛身上的細菌、真菌、線蟲等以及周圍蚊蠅等昆蟲時,使用的殺蟲劑、殺菌劑混入生乳中。乳及乳制品中農藥殘留對人體的危害為微劑量、長時期、慢性細微毒性效應[5]。主要國家和組織涉及乳及乳制品中農藥最大限量443種,歐盟限定數量323種,占72.9%,其目的除了保護人體健康外,利用殘留限量及其檢測技術設置貿易障礙,作為國際貿易的技術壁壘[6]。我國GB 2763-2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》[7]中規定了在食品中433種農藥的4140項殘留限量,在乳及乳制品中設定了硫丹、艾氏劑、滴滴涕、狄氏劑、林丹、六六六、氯丹和七氯八項限量。

1.1.3 獸藥殘留 獸藥殘留是指動物產品任何可食用部分中所有與藥物有關的物質殘留,包括原藥及其代謝產物。奶牛在喂養的過程中不合理使用β-內酰胺類、氨基糖苷類、大環內酯類、喹諾酮類、苯并咪唑類、四環素類、磺胺類等治療藥物與飼料藥物添加劑,飼養場周圍土壤與水源污染,導致獸藥殘留在乳及乳制品中廣泛存在[8]。獸藥殘留對人體健康的危害表現在細菌耐藥性、腸道菌群失調癥、過敏反應、變態反應、激素作用、以及致癌作用和致畸作用等方面[9]。除此之外,因具有抑菌作用,獸藥殘留還會影響發酵乳[10]、奶酪[11]等發酵型乳制品的加工工藝。日本規定獸藥限量418種,歐盟和我國制定的獸藥限量分別為390和45種[12]。

1.1.4 塑化劑 乳及乳制品中塑化劑主要來源于包裝材料中塑化劑遷移,包材在生產、加工過程中通常需要添加塑化劑以增強塑料的柔韌性能[13]。塑化劑為脂溶性物質,而塑料本體結構與塑化劑間通過氫鍵和范德華力相連接,結合不緊密,所以乳及乳制品易被塑化劑污染[14]。最常用的塑化劑是鄰苯二甲酸酯類化合物,包括鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)、鄰苯二甲酸二異癸酯(DIDP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)等。該類物質為“環境激素”,會引發心血管疾病,損害肝臟和泌尿系統,導致生殖功能紊亂、致畸、致癌并對機體的免疫功能造成影響[15]。

1.1.5 真菌毒素 奶牛食用被真菌毒素污染的飼料是導致鮮乳中含有真菌毒素的主要原因,其在乳及乳制品中的污染水平與毒素種類主要由喂養飼料被真菌毒素所污染程度決定。飼料儲存或加工不當,如玉米在生長、收獲及后期的貯存過程中發霉,產生黃曲霉毒素[16],奶牛食用被黃曲霉毒素、伏馬毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素等真菌毒素污染的飼料后,在擠出的鮮乳中可檢測到相應真菌毒素[17]。此外,除了伏馬毒素B1,其余真菌毒素可經牛體代謝轉化,例如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇轉化為環氧-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,黃曲霉毒素B1轉化為黃曲霉毒素M1,玉米赤霉烯酮轉化α-玉米赤霉烯醇,T-2毒素轉化為HT-2毒素,赭曲霉素A轉化為赭曲霉素-α等多種代謝產物,因而,乳及乳制品中的真菌毒素包括飼料中原毒素及其毒性更高的代謝產物[18],其中黃曲霉毒素M1為二類致癌物,黃曲霉毒素B1為一類致癌物,可引起生長障礙、急性中毒、急性肝炎和肝細胞脂肪變性[19]。

表3 真菌毒素從飼料到牛奶的轉移轉化[20]Table 3 Mycotoxin transfer from feed to milk conversion[20]

1.2 篩查分析技術的定義

歐盟2002/657/EC將篩查分析技術定義為一種用于檢測基質中關注的目標物質是否存在并予以定量的技術手段,該方法具有高通量與快速分析兩個特點。篩查分析技術主要分為兩類,第一類為已知目標化合物的篩查,即根據待分析目標化合物的性質與基質類型選擇相應的前處理手段與檢測儀器進行分析,這類確定對象的篩查分析技術與多組分化合物的檢測技術不同之處為:其待分析化合物數目通常為200～500個,需要進行快速、高通量分析。第二類為未知目標物篩查技術,需要在海量的數據中篩選與確證,外源性風險物質與其性質的差異,決定了篩查分析技術所選用的儀器為高分辨率色譜或質譜,且需要運用化學計量學方法進行實驗條件優化與數據處理。

2 二維色譜在乳及乳制品風險物質篩查方面的應用

復雜體系分離為食品分析的難點與熱點,多維聯用色譜技術為其提供了有力手段。使用傳統的色譜分離方法,化合物色譜峰的重疊影響定性與定量結果準確度,而解決方法為提高色譜分離系統的峰容量[21],因色譜分辨率與色譜柱長度平方根成正比,分離時間與色譜柱長度成正比。同時,色譜峰的半峰寬隨著升溫速度減緩而增加,影響化合物檢測限,所以通過提高柱選擇性與柱效難以得到準確的分析結果,而最佳的解決方法為采用多維色譜技術[22-23]。多維色譜技術具有高峰容量、高靈敏度、瓦片效應和族分離、分離時間短等特點[24]。色譜與質譜聯用技術因其選擇性和特異性好、靈敏度高等特點而成為食品分析的常用方法。但低分辨質譜對于未知風險物質的鑒定有一定局限性,而離子阱質譜與飛行時間質譜等高分辨質譜可得到精確質量數,與二維色譜聯用可為目標化合物乃至未知物的分析提供全面的數據,已成為風險物質篩查分析的先進方法。

全二維氣相色譜(Comprehensive two-dimensional gas chromatograph,GC×GC)是將兩根彼此獨立且分離機理不同的色譜柱經過調制器連接而成的二維色譜系統。第一根色譜柱選用液膜較厚且較長的非極性柱,第二根色譜柱為液膜較薄且較短的手性柱或極性柱,兩根色譜柱通過空毛細管連接。調制器為全二維氣相色譜的核心系統單元,工作時冷氣和熱氣周期性交替噴在毛細管柱上,第一根色譜柱流出的組分周期性的被捕集于冷噴點,對揮發性相近的組分聚焦,熱噴將聚焦的組分脫附并徑向脈沖式引入第二根色譜柱的柱頭[25]。調制器將第一維色譜柱后流出組分切割為連續的切片(每個色譜峰分割為3～4個切片),每個切片再通過第二根色譜柱分離。檢測器需要較小的內部體積,較短的響應時間和足夠高的數據采集頻率,以確保二級譜圖的準確構建。經檢測器分析后得到三維色譜圖,x軸與y軸表示二維的保留時間,z軸為色譜峰響應強度[26]。其工作原理圖如圖3所示[27]。正交分離使二維色譜系統的最大峰容量近似等于兩根色譜柱各峰容量乘積,被廣泛應用于復雜樣品基質分析。

圖3 全二維氣相色譜工作原理圖Fig.3 Working principle diagram of GC×GC

二維液相色譜(Two-dimensional liquid chromatography,LC×LC)是將兩個獨立液相的分離技術系統應用于樣品,被測樣品通過柱結合技術進行柱間切換,從而完成在兩根色譜柱之間的流動[28]。分析時,樣品經第一維色譜柱分離、濃縮、捕集或切割后切換入第二維色譜柱中,其工作原理圖如圖4所示[29]。LC×LC分為離線和在線兩種模式,離線模式是指第一維所流出的組分經收集后,依次進入第二維色譜柱中,可對每一維色譜柱的分離參數進行單獨優化。在線模式是指第一維所流出目標組分直接被切入第二維,二維間的接口為核心裝置[30]。而根據第一維流出的組分是否全部進入第二維色譜柱,可將二維液相色譜分為中心切割二維液相色譜和全二維液相色譜。二維液相色譜已經被廣泛地應用在蛋白質表征,生物制藥、天然產物研究及食品分析等方面。

圖4 二維液相色譜工作原理圖Fig.4 Working principle diagram of LC×LC

2.1 農藥、獸藥及環境持久性污染物分析

乳及乳制品基質復雜,藥物及其代謝產物的檢測過程涉及大量化合物。這些化合物的存在,使得乳及乳制品中藥物及代謝產物的痕量分析甚至超痕量分析變得更為困難,所以選擇高靈敏度、高分辨率以及高檢測通量的分析儀器尤為重要[31]。Wang等[32]使用二維液相色譜質譜聯用技術(LC×LC-MS)分析了乳制品中七類20種抗生素殘留。實驗采用基質固相分散體提取,用乙腈和水洗脫,旋轉蒸發干燥,流動相定容后進行分析。奶粉和牛奶樣品中各抗生素的檢測限和定量限分別為0.10～2.40和0.33～7.92 μg/kg。人體攝入的持久性污染物(POPs)有95%來自于食品中,其中有些POPs是致癌物質,可能對胃、腎臟、脾臟、肝臟以及心血管、神經、循環、生殖、免疫和呼吸系統產生不利影響。目前食品中持久性污染物的分析已成為熱點問題[33]。Douglas等[34]采用全二維氣相色譜-飛行時間質譜(GC×GC-TOF-MS)對牛奶和奶油中34種農藥異構體和代謝物進行了多殘留分析。實驗回收率為66%～84%,檢出限均低于0.4 μg/kg。Korytár[35]采用GC×GC分析了牛奶中30種持久性污染物。實驗RSD為1.5%～6.5%,獲得滿意的線性和重復性。David等[36]在MRM模式下,通過全二維氣相色譜串聯質譜法(GC×GC-MS/MS)分析奶粉中的七種多氯聯苯(PCB)同系物。與GC-MS/MS對比,GC×GC-MS/MS需注射劑更少,且分析速度為GC分離的2倍。實驗線性和重現性良好,可用于復雜食品基質和痕量PCB的檢測。Jeremy[37]等以固相微萃取為前處理手段,對比氣相色譜-四極桿質譜(GC-Quad/MS)和GC×GC-TOF-MS對牛奶中的苯和鹵代化合物的分析結果。苯系化合物的數量從5個增加到66個,鹵代化合物的數量從2個增加到22個,該實驗表明GC×GC-TOF-MS的分析能力遠遠高于GC-Quad/MS,在共洗脫分析物和基質成分中分離毒性化合物的分析方面更具優勢。Focant[33]等建立13C標記的同位素稀釋GC×GC-TOF-MS法,用于檢測牛奶、豬肉和魚中17種二噁英(PCDD/Fs)和18種PCB。其中TOF-MS不太可能受到樣品提取物質量影響,保證了分析方法的穩定性。該方法可在對污染物進行追溯查詢時可準確確證PCB和PCDD/F同系物。

2.2 食品添加劑及非法添加物分析

食品添加劑是食品工業的重要組成部分,在改善食品的色、香、味,調整食品的營養結構、提高食品質量和延長保存期等方面,有著舉足輕重的作用,被廣泛地應用于各類食品中[38]。但國家標準與法規中規定在純牛奶中禁止添加任何防腐劑、香精、著色劑、增稠劑等食品添加劑,因此對乳品中食品添加劑的篩查尤為重要。中心切割二維液相色譜因樣品制備簡單、樣品損失少、回收率高且自動化程度高等特點,廣泛應用于乳制品的質量控制分析。Hou等[39]建立了中心切割二維液相色譜法,用于同時定量分析酸奶五種添加劑。與單純使用一維色譜分離相比,化合物回收率由75.1%～110.4%提高至94.5%～103.9%,表明全二維氣相色譜法的檢測限和線性動態范圍明顯優于傳統的一維色譜方法。在隨后研究中,Hou等[40]以牛奶和奶粉中麥芽酚、乙基麥芽酚、香草醛、乙基香蘭素、苯甲酸、山梨酸和糖精鈉為研究目標,Venusil XBP-C4色譜柱作為第一維柱,第二維采用Hypersil ODS-2 C18色譜柱,樣品前處理采用稀釋直接進樣法,回收率為90.6%～105.4%,分析時間縮短且使用的溶劑更少。陳亮等[41]對牛奶中的糖精鈉、苯甲酸、山梨酸、麥芽酚、乙基麥芽酚、乙基香草醛與香草醛等12種成分進行分析。樣品僅需經過稀釋、過濾兩個預處理步驟便可進樣測定。以Venusil XBP-C4柱作為第一維色譜柱,第二維分析柱采用Hypersil ODS-2 C18柱,12種待測物線性關系良好,日內、日間精密度較高,回收率范圍為89.6%～105.4%,該方法可以很好的應用于測定乳及乳制品中的人工添加劑和香精成分。陳琦等[42]使用GC×GC-TOF-MS在20.5 min內可實現食品樣品中19種防腐劑、抗氧化劑與13種非法添加物的快速分離與定性。對于乳制品樣品,實驗萃取溶液使用40 mL乙腈飽和的正己烷,加入8 g無水MgSO4脫水,以0.25 μm膜過濾,用乙腈稀釋5倍進樣。實驗32種化合物檢出限均低于0.5 mg/kg。

2.3 風味成分分析

牛奶中含有較多種類脂肪酸,是人體短鏈脂肪酸的重要來源,在加工過程中脂肪酸會發生一系列的自動氧化、分解、脫水、脫酸等反應,最終生成的2-戊酮,2-庚酮等化合物,具有較強的香氣,是乳及乳制品主要香氣來源[43]。Villegas等[44]將GC×GC與大氣壓電離質譜聯用,建立了牛奶中順式和反式十八碳脂肪酸的九種異構體篩查分析方法。Jaeho等[45]使用GC×GC和GC×GC-TOF-MS進行反油酸和異油酸兩種反式脂肪酸的分離。實驗日內重復性的RSD分別為≤9.56%和≤9.97%,日間重復性的RSD分別為≤8.49%和≤9.06%。實驗發現異油酸與反油酸的比值可用來區分天然和氫化反式脂肪酸,評估乳制品的質量。周瑞澤等[46]使用GC×GC-MS建立了天然奶油和人造奶油中37種脂肪酸的檢測方法,實現了37種脂肪酸的有效分離和準確測定。該方法定性準確,有助于根據脂肪酸種類及含量的不同進一步區分天然奶油和人造奶油,為奶油品質評價、摻假鑒別等食品安全保障工作提供有力的技術支撐。

Vlaeminck等[47]利用脂肪酸不飽和鍵排布的規律與不飽和程度,基于GC×GC建立了牛奶中非靶標脂肪酸高通量篩查分析方法,該方法奠定了乳品風味化學的研究基礎。Stella等[48]將離子色譜與反相液相色譜聯用(IC×RPLC)用于分析發酵乳、橙汁和葡萄酒中24種小分子有機酸,目標化合物在三維譜圖中呈正交分布,檢出限與定量限均滿足分析需求。Cordero等[49]利用GC×GC-MS,基于動態頂空技術建立了全脂乳粉和脫脂乳粉中風味物質的比對方法,在獲取兩種乳粉指紋譜圖的基礎上結合主成分分析法,成功地確定了211種揮發物和半揮發物,從而確定了全脂乳粉和脫脂乳粉的風味化合物組成。Yue等[50]采用GC×GC-TOF-MS,運用固相微萃取技術作為前處理方式,對牛奶中的揮發性物質進行分析,不僅分離出了傳統氣相色譜-質譜聯用可檢測出的52種化合物,而且還鑒定出了在牛奶中未曾報道的107種化合物。GC-MS會造成組分共洗脫,不足以分離所有揮發性組分。而GC×GC-TOF-MS具有高峰容量,靈敏度和選擇性,是定性和定量分析復雜基質樣品的有效方法。在牛奶中揮發性物質的檢測方向有良好前景。Ma等[51]建立了一種新的LC×LC方法,將從第一維色譜柱(C4)中洗脫的目標餾分儲存在捕獲柱(C8)上,通過六通切換閥將化合物切換入第二維色譜柱(C18),為了評估該方法的適用性,實驗對市場銷售的嬰幼兒配方乳粉中的麥芽酚、乙基麥芽酚、香草醛和乙基香蘭素進行了分析,其中在兩個樣品中分別檢測到了香草醛和乙基香蘭素。

3 結論

乳及乳制品基質復雜,傳統的色譜技術由于其峰容量不足,分辨率較低等缺點,導致共流出物峰重疊現象嚴重,利用二維色譜技術分離分析乳及乳制品樣品時,不僅能提高樣品各組分的分離能力,而且在與質譜技術聯用時,可以提高對樣品各組分的定性與定量能力。目前,二維色譜技術的研究領域集中于二維分離體系中的接口技術研究[52]、與各種新型質譜技術進行有效聯用[53]、利用新材料與新型離子化技術對復雜基質中多價態化合物進行高精確質量和高分辨率表征領域。復雜體系的分離為分析化學的難點與熱點,多維聯用色譜技術為復雜體系分離提供了有利手段,是實現食品中非靶標化合物篩查研究的主要突破點。