激光掃描共聚焦顯微鏡操作人員培養模式探索

于博昊， 吳 婷， 張 磊

(華東理工大學 化學與分子工程學院，上海 200237)

0 引 言

近年來，隨著科研水平的不斷提高，以及國家和地方對高校教育資金的大力投入，激光掃描共聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM)的表征應用越來越廣泛，已成為很多高校的必備儀器。但是，由于其屬于精密大型儀器設備，價格昂貴、環境要求條件高、且維護費用高，目前國內大多數高校將其歸屬于校級分析測試中心或者部分研究課題組。為改善當前這種統一管理、專人專職負責、委托測樣模式所帶來的儀器使用時間受限、使用效率偏低等問題[1-4]，充分發揮LSCM在教學、科研和人才培養中的作用，提高儀器的使用效率，需要建立LSCM開放測試平臺，規范管理、優化資源、合理布局[5-12]。因此，LSCM開放共享自主上機操作人員的培訓就成為開放共享的核心問題。這些年來，邊摸索邊實踐，在LSCM操作人員培養模式方面不斷探索，積累了一定的經驗和方法，得到了令人滿意的培養模式。

1 儀器特點決定需求強度

與一般顯微鏡相比，LSCM具有不可比擬的優越性[13-15]。作為一種較新的研究工具，LSCM可以對樣品定性、定量、定時和定位研究，正是由于這些強大的研究功能，目前，LSCM已廣泛用于免疫學、藥理學、病理學、遺傳學、分子生物學、材料科學、食品科學等研究領域[16]。基于此，我校分析測試中心購置的Nikon A1R 型LSCM自2011年啟用以來，該儀器的需求一直居高不下，正常委托測試時間內無法充分滿足師生的科研需求，開放共享迫在眉睫。

2 自主上機操作人員培養模式初探

要順利實現和運轉LSCM開放共享，需要不斷發展壯大自主上機人員梯隊建設，需要有一個完善的培訓考核制度。

一直以來，分析測試中心面向在校研究生開設現代儀器分析實驗技術選修課程，由學生自主選取感興趣的儀器進行學習，主要以見習為主。LSCM這一課程，每年吸引了大量研究生前來選課。由于時間所限，只能從觀、聞、查、寫4個方面簡單展開，課堂上老師講解LSCM儀器原理、功能、應用等，現場展示儀器測試樣品過程。課后，學生利用網絡、書籍等進一步檢索該儀器的相關知識文獻，自己總結撰寫實驗報告，進一步加深對該儀器的理解。該課程是一門較好的儀器入門課程，深受學生喜愛。但是僅靠一堂課不足以讓學生充分掌握儀器的使用方法，也遠遠不能滿足他們獨立自主上機操作的要求。

中心在開放共享初期嘗通過學生自主報名，按照需求強度和報名順序依次進行培訓，考核通過后簽訂協議，授予自主上機資格。此法在一定程度上解決了儀器開放初期人員上機資格的認定問題，但還是存在尚未解決的難題，比如如何公平確認獲得培訓資格？如何認定培訓老師的工作量？如何在學生畢業后若干時期內對其實驗操作技術給予證明和確認等一系列問題。由此，設想從現代儀器分析實驗技術這一課程著手，由淺入深，建立進階分級課程。后續，在學校各相關領導和部處的幫助下，成功將LSCM培訓體系納入到研究生選課系統，即設立以見習為主的LSCM分析實驗技術A課和以自主上機培訓為主的LSCM分析實驗技術B課，由不同需求的學生進行選擇。這樣，學生可以實現各取所需。通過選修LSCM分析實驗技術A課，對儀器有了基本的感性認識，如果需要進一步大量使用該儀器，可以選修LSCM分析實驗技術B課。該課程每學期開設一次，共2學分，32學時，分為8次課進行。課程結束后，每位同學進行上機盲樣考核，考試合格后獲得自主上機資格。

3 課程建設覆蓋若干要素

設立LSCM分析實驗技術B課后，在全校選課平臺上學生可有的放矢進行選課，確保公平公正；承擔LSCM分析實驗技術B課的老師會在講授A課的基礎上，主要培養每位同學的上機操作實踐能力，確保每位同學能夠實現完全獨立上機，制定一套完整的理論體系和模式。該課程考核后錄入的成績會在學生的成績單上有所體現，這既是對選修該課程學生的一種監督鞭策，也可以證明學生具有的儀器操作能力，對他們日后的深造和工作均是一種能力印證。在課程建設中著重從以下幾點進行培養，這幾點構成了課程建設的必備要素，形成了具有鮮明特色的實驗教學方法和培養模式(見圖1)。

3.1 注重安全制度教育

LSCM分析實驗技術B課開課伊始，首先給同學們講解實驗室安全管理條例和各項規章制度，明確實驗室的水、電、門、窗位置，消防通道位置，讓同學們做到心中有丘壑，牢固樹立安全防護意識，時刻繃緊安全保障這根弦，防患于未然，安全防護無死角。

3.2 強調儀器使用環境要求

與普通實驗室相比，儀器分析實驗室環境條件要求更苛刻，環境硬件配置要求更高。LSCM實驗室內要配備空調，確保環境溫度保持在20～24 ℃，同時要配備除濕機以維持一定的濕度，確保環境相對濕度保持在40%～60%。有條件的還可以配備UPS不間斷電源，以防突然斷電。

3.3 樹立安全防護意識

LSCM大多數檢測樣品是與生物樣品相關的，因此要讓學生首先做好生物安全意識，配備實驗大衣、乳膠手套、無菌口罩等。①確保實驗樣品不受污染，②保證學生人身安全。同時，強調測試結束后，要將樣品自動分類回收，不對環境造成污染。

3.4 實行分階段分組練習

整個課程分為3個階段，第1～3次課為第1階段，第4～6次課為第2階段，第7～8次課為第3階段。每個階段有不同的課程目標，階段復習，階段測試。

在進行上機培訓時，劃分若干小組，這樣可以節約學生等待時間，最大限度地讓同學在有限的時間內得到更多的鍛煉。起初，老師會結合儀器操作手冊，給他們講解儀器硬件名稱、功能、使用順序，然后逐一講解軟件各模塊各個按鈕和快捷鍵的功能，如何利用不同的參數拍攝出高質量的圖片。同時現場演示講解樣品測試過程，選擇性地給出儀器操作中的某些可供參考經驗值，以方便同學們借鑒。

3.5 循序漸進，化整為零，師生互動

第1階段每次上課時，老師與學生共同復習上節課講述的理論知識，加深對理論知識的理解和梳理。然后測試提問學生關于儀器操作步驟和軟件功能的使用。最后，詢問學生是否還有問題，進行現場答疑。這樣的復習方法看似繁冗實則必要，任何一個學習過程都是循序漸進的反復過程，一個同學默默地機械記憶反而不如幾個同學一起交流切磋有效。

在關鍵的儀器操作練習培訓過程中，先從樣品性質出發，讓學生明確樣品測試條件，準確設置測試參數。再講述操作要點，學生親自動手上機練習。一開始，每個同學輪流就位，老師一邊陳述，一邊向學生詳細講解每一步驟如何操作拍攝，包括在不同模式下顯微鏡中確定樣品視野、切換掃描模式、調節掃描參數、拍攝各種模式圖片等。學生聽從老師指令，一步一步地操作，而后每個同學依次上機。這樣的手把手教學方法開始很辛苦也很費時間，但是幾個同學輪流一次后，相當于反復學習了幾次，記憶比較深刻，有利于學生后面快速上手。在此過程中，采取先易后難，先簡后繁的原則。低倍鏡頭景深長，視野范圍大，相對容易觀測到樣品，因此選擇從低倍鏡頭開始練習；檢測熒光標記的細胞，其難易程度跟樣品前處理有很大關系，比如細胞接種密度，細胞狀態、標記效果等因素，而某些熒光標記的材料狀態相對穩定，焦面易確定，所以開始練習時往往選擇熒光標記的材料進行適應性訓練。通過前面3次課程的適應訓練要達到如下考核目標：① 明確儀器開關機使用順序，知曉基礎硬件名稱和功能；② 根據樣品性質，設置合理的拍攝參數；③ 掌握高倍、低倍鏡頭顯微鏡明場找視野的步驟和方法；④ 掌握預覽圖像、確認焦面、調整參數、優化圖像以及拍攝二維圖像的步驟和方法。在階段總結時要告知同學們容易出現錯誤的環節，及時糾正。此時，再給他們說明一些應急策略，比如應對儀器開機軟件無法連接、桌面快捷方式失靈、如何調用以往參數設置等等。并多次強調用4項法則來訓練:盡量慢、不怕停、多動手、積累經驗。

接下來的3節課是第2階段，這個階段是儀器操作的進一步深入練習，所授知識涵蓋所有儀器操作要素，同時老師根據每個同學情況進行針對性的指導。在第1階段4項目標(①-④)的基礎上，要求達到以下目標：⑤掌握高倍、低倍鏡頭顯微鏡熒光場找視野的步驟和方法；⑥掌握明場DIC(微分干涉)拍攝的步驟和方法；⑦掌握三維圖像的掃描和重構；⑧掌握掃描區域電子放大的方法和步驟；⑨掌握掃描大圖的方法和步驟；⑩掌握拍攝X-Y平面時間序列圖片的方法和步驟；掌握圖片的后期圖像、數據處理等軟件附加功能。此過程中，強調兩多一少法則：多嘗試、多調節、少失誤。加上前面4項法則，形成LSCM自主上機課程培訓黃金七法則。

經過6次課訓練，學生一定程度上已經具有獨立操作能力，但是熟練程度不夠。最后2次課完全放開，讓他們繼續練習，做到有的放矢、準確操作、提高速度、降低失誤。8次課程過后，基本上每個同學都可以勝任自主上機。個別不熟練的同學可以在合適的時間內再加強練習。

3.6 培養良好的自主上機習慣

良好的實驗習慣有助于學生獲取理想的實驗結果，有利于維持良好的自主上機秩序，是LSCM開放共享的基礎。要求學生在自主上機過程中，做好大型儀器運行日志的記錄和儀器自主上機交接記錄本的記錄，這是儀器使用情況的溯源保證，一旦發生儀器使用不當導致損壞，可以確保儀器損壞責任的公正認定和情況調查，是供需雙方維權的根本保障。同時，要求學生確保實驗室的各項衛生干凈整潔。上機結束后，確保水、電、門窗關閉和安全。這些要求貫穿于整個培訓課程過程中，需要每位同學在課程中時刻注意，形成習慣。

3.7 考核

LSCM分析實驗技術B課考核內容包括樣品的制備、檢測設備相關知識、儀器操作及參數設置。要求每位同學準備兩色或者三色熒光標記樣品以備考核使用。每位同學單獨上機，樣品交叉盲樣考核?？己诉^程中涉及軟硬件啟動順序、顯微鏡確定視野、樣品拍攝參數設置、常規圖片采集及圖像參數設置調整等。

歷時8周，同學們基本上都能通過考核，順利得到自主上機資格。如果綜合素質確實不能符合要求的，也會果斷給予成績不達標，不予通過。必須做到嚴把人員第一關，確保儀器開放共享的有序順利開展。

通過考核的同學方能簽訂三方協議，在預約系統里預約時間自主上機。

4 結 語

近年來，通過LSCM分析實驗技術B課共培養自主上機同學100余名，得到全校師生們的極大支持和響應，每次選課都是供不應求，同學們也十分珍惜來之不易的學習機會。本課程的發展和研究生的培養共同發展，互為反哺。積極聽取師生們的意見和建議，為了拓寬眼界，中心陸續開展了儀器應用講座，邀請儀器應用工程師跟大家分享儀器使用技巧，圖片處理工具的使用，進一步豐富了同學們的儀器應用知識，使得該課程建設上升為“一點帶動，雙箭齊發，三方共建”的局面，收效甚佳。

任何一個培訓和學習的過程都是一個量變到質變，質變到飛躍的過程，在尊重學習過程客觀規律的前提下，探索和構建了LSCM分析實驗技術B課這一適合培養研究生儀器操作人員的獨特模式，該培訓課程既引人入勝又事半功倍，它為LSCM儀器開放共享奠定了堅實的人員基礎。對于大型儀器開放共享的人員培訓模式，也需要相關人員進一步地深入挖掘和探索，做到與時俱進，適應不斷發展的時代和教育培養人才的需要。