阿克蘇地區(qū)棗黑斑病菌 PCR 檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

白劍宇，畢司進(jìn)，宋峰惠，史彥江

(1.新疆林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)林研究所，烏魯木齊 830063；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】阿克蘇地區(qū)棗黑斑病病原為鏈格孢菌(Alternariaalternate)[1]。該病原菌致病性強(qiáng)，傳播迅速，具有爆發(fā)性的發(fā)生特點(diǎn)，常常在棗果和葉片上形成黑斑，病果果肉變褐色，并向內(nèi)部延伸。棗黑斑病潛伏期長(zhǎng)，在未表現(xiàn)出癥狀的情況下，直接觀察會(huì)提供錯(cuò)誤判斷，而病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定又容易受人為因素和環(huán)境條件的干擾，加之傳統(tǒng)的分類(lèi)鑒定方法熬時(shí)長(zhǎng)、程序繁瑣，不適合快速檢測(cè)的要求，很難實(shí)現(xiàn)對(duì)病害發(fā)生動(dòng)態(tài)的及時(shí)監(jiān)測(cè)和有效控制病原菌的傳播和病害流行。建立快速、準(zhǔn)確的棗黑斑病菌(A.alternata)分子檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于探索病害防控的關(guān)鍵點(diǎn)以及制定適時(shí)有效的防治措施具有重要的理論和實(shí)際意義。【前人研究進(jìn)展】自林忠敏等[2]報(bào)道了山西省棗果上發(fā)生了一種新病害，并命名為棗黑斑病以來(lái)，該病在山東、河北等[3-4]省市相繼發(fā)生，且病原種類(lèi)與新疆發(fā)生的棗黑斑病的致病病原存在差異，報(bào)道的病原包括細(xì)菌中的黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)和假單胞桿菌屬細(xì)菌(Pseudomonas)[5]，真菌中的桑殼小圓孢菌(Coniothyriumfucsidμlum)、仁果莖點(diǎn)霉(Phomapomirum)、鏈格孢(Alternariaalternata)、細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)和莖點(diǎn)霉屬(Phomasp.)等[6-10]。自2008年以來(lái)，在新疆發(fā)生棗黑斑病主要危害棗樹(shù)的果實(shí)，其次為棗樹(shù)的葉片和花期，致病病原主要為A.alternaria和A.tenuissima兩種[11-13]。2016年白劍宇等[1]對(duì)阿克蘇地區(qū)發(fā)生的棗黑斑病，采用形態(tài)學(xué)觀察、致病性實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)相結(jié)合的鑒定技術(shù)，對(duì)致病病原進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定，明確了阿克蘇地區(qū)棗黑斑病的致病病原為A.alternaria。【本研究切入點(diǎn)】研究阿克蘇地區(qū)棗黑斑病菌 PCR 檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究在準(zhǔn)確鑒定病原(A.alternata)基礎(chǔ)上，利用文獻(xiàn)公布的A.alternata熱休蛋白基因基因特異性引物，通過(guò)PCR反應(yīng)體系優(yōu)化后的引物特異性擴(kuò)增與靈敏度的檢測(cè)，建立棗黑斑病菌(A.alternata)的分子檢測(cè)技術(shù)，利用該技術(shù)在紅棗整個(gè)生育期對(duì)疑似棗黑斑病菌侵染的棗樹(shù)葉片和果實(shí)樣本進(jìn)行病原菌的田間追蹤檢測(cè)，并針對(duì)落葉、落果、枯枝等病殘?bào)w及土壤是否攜帶鏈格孢菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)與分析。通過(guò)病害田間侵染動(dòng)態(tài)和越冬場(chǎng)所的分子檢測(cè)與驗(yàn)證，研究棗黑斑病的田間侵染動(dòng)態(tài)，分析病害防治的最佳時(shí)間，闡明棗黑斑病病原菌的越冬場(chǎng)所，為阿克蘇地區(qū)棗黑斑病的流行監(jiān)測(cè)和早期防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

棗黑斑病菌(A.alternata)為新疆林科院經(jīng)濟(jì)林研究所鑒定保存的菌株；用于引物特異性檢測(cè)的其它7個(gè)真菌菌株由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室保存并提供，包括由蕓苔生鏈格孢(Alternariabrassicae)、瓜鏈格孢(Alternariacucumerina)、長(zhǎng)喙鏈格孢(Alternarialongirostrata)、細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)、侵染鏈格孢(Alternariainfectoria)、米曲霉(Aspergillusoryzae)和灰綠青霉(Penicilliumglaucum)。

1.1.2 供試引物

參考Margaret T. Mmbaga等[14]依據(jù)鏈格孢菌(A.alternata)的熱休克蛋白(Hsp70)序列(GenBank 登錄號(hào)：U87808)設(shè)計(jì)的特異性引物aa-hsp-f1：ATCTCTGCTAAGA- ACGCT CTCG，aa-hsp-r2：ACCAGCTCCGTAGAACTTC ATC，產(chǎn)物大小為237 bp，由北京鼎國(guó)生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.1.3 主要試劑和儀器

美國(guó)伯樂(lè)公司BIO-RAD T100 PCR儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)中國(guó)上海分公司；DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑和質(zhì)粒提取試劑盒以及2×PCR反應(yīng)液等試劑購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 供試菌株培養(yǎng)

將各供試菌株在PDA平板上培養(yǎng)3～5 d，用打孔器打成直徑4 mm的菌餅，轉(zhuǎn)入滅菌后的馬鈴薯液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)5 d，抽濾后凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取與引物的特異性檢測(cè)

取震蕩培養(yǎng)后凍干的各供試菌株菌絲適量，液氮研磨后，分別稱(chēng)取各菌株粉末50 mm，轉(zhuǎn)入2 mL離心管中。采用 CTAB 法提取總 DNA(Lee & Taylor，1990；孟鶴等，2011)作為 PCR模板，對(duì)引物(aa-hsp-f1)/(aa-hsp-r2)進(jìn)行特異性檢測(cè)。PCR 反應(yīng)體系(25 μL)：10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq酶 0.5 μL，模板 DNA 1 μL，dd H2O 19 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃，10 min；94 ℃，1 min，60 ℃，45 s，72 ℃，2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。

1.2.3 引物靈敏性檢測(cè)

將棗黑斑病菌(A.alternata)基因組 DNA 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，按10倍梯度稀釋109、108、107、106、105、104、103、102、10、1cfu/mL系列濃度，采用已建立的PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)引物對(duì)(aa-hsp-f1)/(aa-hsp-r2)的靈敏度。

1.2.4 棗黑斑病田間發(fā)生動(dòng)態(tài)追蹤檢測(cè)

以阿克蘇市依桿旗鄉(xiāng)8大隊(duì)2組紅棗種植園、溫宿縣萬(wàn)畝棗園和阿瓦提縣多浪鄉(xiāng)紅棗示范園，3個(gè)歷年棗黑斑病發(fā)生較重的棗園為樣品采集和檢測(cè)地點(diǎn)，棗樹(shù)品種均為駿棗，樹(shù)齡分別為7a、9a和10a。自每年棗樹(shù)展葉起，分別于5月、6月、7月、8月、9月和10月采集疑似棗黑斑病果實(shí)和葉片樣品各50份，提取各樣品總DNA，利用已建立的PCR分子檢測(cè)體系，進(jìn)行棗黑斑病菌田間發(fā)生動(dòng)態(tài)的追蹤檢測(cè)。表1

1.2.5 病原菌越冬場(chǎng)所的分子檢測(cè)

2016年分別與秋冬兩季收集棗園中的棗樹(shù)樹(shù)上和樹(shù)下落葉、落果等病殘?bào)w及冠下表層土壤樣本各25份，依據(jù)植物及土壤DNA提取試劑盒操作說(shuō)明分別提取樣本總DNA，作為 PCR 反應(yīng)模板。利用已建立的棗黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)，針對(duì)各樣本是否攜帶棗黑斑病菌進(jìn)行快速檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的特異性檢測(cè)

以滅菌后的雙蒸水為陰性對(duì)照，以 10 個(gè)供試菌株的基因組 DNA 為模板，檢測(cè)(aa-hsp-f1)/(aa-hsp-r2)引物的特異性，結(jié)果表明，以棗黑斑病菌(A.alternata)DNA 為模板，可以穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出 237 bp 的單一片段(圖13)，其它6個(gè)菌株均未擴(kuò)增出條帶，且目的片段條帶明亮，擴(kuò)增穩(wěn)定性及特異性好。

注：M：100 bp Marker；1～3：鏈格孢菌；4～5：蕓苔生鏈格孢；6～7：瓜鏈格孢；8～9：長(zhǎng)喙鏈格孢；10～11：細(xì)極鏈格孢；12～13：侵染鏈格孢；14～15：米曲霉；16～17；CK：陰性對(duì)照。

Note： M: 100 bp Marker; 1-3:A.alternata; 4-5:Alternariabrassicae; 6-7:A.cucumerina; 8-9:A.longirostrata; 10-11:A.tenuissima; 12-13:A.infectoria; 14-15:Aspergillusoryzae; 16-17:Penicilliumglaucum; CK: Negative control

圖1 棗黑斑病菌引物的特異性PCR檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果
Fig.1 The amplification results of black spot of jujube by PCR

2.2 引物的靈敏性檢測(cè)

棗黑斑病菌(Alternariaalternata)DNA 分光光度計(jì)測(cè)定濃度為488.6 ng/μL ，將初始 DNA 按10倍梯度稀釋至 10-5(4.886 pg/μL)仍能檢測(cè)到 DNA 的存在，說(shuō)明(aa-hsp-f1)/(aa-hsp-r2)引物用于 PCR 檢測(cè)棗黑斑病菌時(shí)具有較高的靈敏度，可以用于棗黑斑病菌的田間發(fā)生動(dòng)態(tài)的追蹤檢測(cè)和病原菌越冬場(chǎng)所的檢測(cè)與驗(yàn)證。圖2

注：M：DNA Marker；1～9：DNA 依次稀釋梯度為 1～10-9；CK：陰性對(duì)照

Note： M: DNA Marker; 1 ～ 9: Serial dilution of DNA 1-10-9; CK: Negative control

圖2 棗黑斑病菌普通 PCR引物靈敏性檢測(cè)
Fig.2 Sensitivity detection of common PCR primer in black spot pathogen of jujube

2.3 棗黑斑病田間發(fā)生動(dòng)態(tài)的追蹤檢測(cè)

研究表明，在不同年份不同地塊采集的病害樣本中均可檢測(cè)到棗黑斑病菌的存在，且隨著月份的增加，病原菌檢出率呈升高趨勢(shì)。其中5～6月采集的棗樹(shù)葉片樣本的病菌檢出率相對(duì)較低，最高檢出率為40%，最低檢出率為8%，而在7～10月采集的葉片樣本中病害檢出率相對(duì)較高，最高檢出率為76%，最低檢出率為44%；7～8月采集的棗樹(shù)果實(shí)樣本的病菌檢出率相對(duì)較低，最高檢出率為44%，最低檢出率為8%，而在7～10月采集的葉片樣本中病害檢出率相對(duì)較高，最高檢出率為78%，最低檢出率為52%。表1

表1 樣品材料及棗黑斑病田間發(fā)生動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果
Table 1 Specimen materials and the detection results of dynamic condition of black spot of jujube in field

采集地點(diǎn)Collection location采集時(shí)間Collection time樣本類(lèi)型及數(shù)量Type and number of samples帶菌樣本數(shù)量Sample number of pathogen病原菌檢出率Detection rate of pathogens年度Year月份Months葉片Leaf果實(shí)Fruit葉片Leaf果實(shí)Fruit葉片Leaf果實(shí)Fruit總檢出率Total detection rate阿克蘇市依桿旗鄉(xiāng)8大隊(duì)2組2015年2016年550-14-0.28-0.28650-16-0.32-0.32750502640.520.080.308505030120.600.240.429505032340.640.680.6610505026320.520.640.58550-12-0.24-0.24650-12-0.24-0.24750502260.440.120.288505028140.560.280.429505026300.520.600.5610505030360.600.720.66溫宿縣萬(wàn)畝棗園2015年2016年550-8-0.16-0.16650-18-0.36-0.36750502280.440.160.308505028180.560.360.469505034300.680.600.6410505034390.680.780.72550-4-0.08-0.08650-14-0.28-0.287505020160.400.320.368505022220.440.440.449505026260.520.520.5210505036300.720.600.66阿瓦提縣多浪鄉(xiāng)紅棗示范園2015年2016年550-14-0.28-0.28650-20-0.40-0.407505032240.640.480.568505038300.760.600.689505034360.680.720.7010505034380.680.760.72550-12-0.24-0.24650-14-0.28-0.28750502080.400.160.288505030220.600.440.529505038320.760.640.7010505036340.720.680.70

2.4 病原菌越冬場(chǎng)所的分子檢測(cè)

利用已建立的棗黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)，針對(duì)冬春兩季收集的棗樹(shù)樹(shù)上、樹(shù)下殘留的病葉、病果及冠下表層土壤樣本是否攜帶棗黑斑病菌進(jìn)行快速的檢測(cè)，研究表明，冬、春兩季采集的病果、病葉及棗樹(shù)冠下表層土壤等病殘?bào)w均能檢測(cè)到棗黑斑病菌的存在，三者之間帶菌率存在明顯差異，其中病果帶菌率遠(yuǎn)高于病葉及表層土壤帶菌率，表層土壤樣本帶菌率最低。冬季病殘?bào)w及表層土壤樣本總帶菌率略高于春季樣本的總帶菌率，其中冬季樹(shù)上病果的帶菌率在68%～96%，樹(shù)下病果的帶菌率在80%～92%；春季樹(shù)上病果的帶菌率在76%～84%，樹(shù)下病果的帶菌率在80%～92%，而病葉無(wú)論樹(shù)上還是樹(shù)下樣本，其帶菌率均較低，最高帶菌率為56%，最低帶菌率為24%。棗樹(shù)冠下表層土壤的帶菌率最高為56%，最低帶菌率為36%，而以樹(shù)上殘留的健康棗果和葉片均未檢測(cè)到棗黑斑病菌的存在。表2

表2 棗黑斑病樣品材料及越冬場(chǎng)所分子檢測(cè)結(jié)果
Table 2 Specimen materials and the detection results of overwinter sites of black spot of jujube in field

采集地點(diǎn)Collection location樣本類(lèi)型Types of samples樣本數(shù)量Number of samples帶菌樣本數(shù)量Sample number of pathogen病原菌檢出率Detection rate of pathogens (%)總檢出率(%)Total detection rate冬季春季阿克蘇市依桿旗鄉(xiāng)8大隊(duì)2組冬季樹(shù)上殘留病果252496冬季樹(shù)上殘留病葉25936冬季樹(shù)下殘留病果252288冬季樹(shù)下殘留病葉251456冬季冠下表層土壤251352春季樹(shù)上殘留病果252184春季樹(shù)上殘留病葉25624春季樹(shù)下殘留病果252392春季樹(shù)下殘留病葉251352春季冠下表層土壤25145665.661.6溫宿縣萬(wàn)畝棗園冬季樹(shù)上殘留病果252080冬季樹(shù)上殘留病葉251144冬季樹(shù)下殘留病果252080冬季樹(shù)下殘留病葉251560冬季冠下表層土壤251352春季樹(shù)上殘留病果251976春季樹(shù)上殘留病葉25832春季樹(shù)下殘留病果252184春季樹(shù)下殘留病葉25728春季冠下表層土壤25114463.252.8阿瓦提縣多浪鄉(xiāng)紅棗示范園冬季樹(shù)上殘留病果251768冬季樹(shù)上殘留病葉25728冬季樹(shù)下殘留病果252392冬季樹(shù)下殘留病葉251144冬季冠下表層土壤251144春季樹(shù)上殘留病果251976春季樹(shù)上殘留病葉25728春季樹(shù)下殘留病果252080春季樹(shù)下殘留病葉25936春季冠下表層土壤2593655.251.2

3 討 論

在南疆紅棗生產(chǎn)過(guò)程中，由鏈格孢菌(A.alternata)引起的棗黑斑病不僅危害棗果，而且危害棗樹(shù)葉片和花器，受害果實(shí)多在棗果泛白期開(kāi)始顯癥，而泛白期前病害癥狀不明顯，通常忽略前期對(duì)棗黑斑病的防治，僅在棗果顯癥期進(jìn)行防治，致使防治效果很難達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)。因此，利用分子檢測(cè)技術(shù)開(kāi)展棗黑斑病的早期監(jiān)測(cè)，探索病害防治的關(guān)鍵時(shí)間節(jié)點(diǎn)顯得尤為重要。Margaret T. Mmbaga等[14]依據(jù)鏈格孢菌(A.alternata)的熱休克蛋白(Hsp70)基因序列設(shè)計(jì)出特異性引物，建立了針對(duì)A.alternata常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)來(lái)鑒定和檢測(cè)病原菌。試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上利用引物對(duì)(aa-hsp-f1)/(aa-hsp-r2)對(duì)棗黑斑病菌進(jìn)行的常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為237 bp，檢測(cè)的靈敏度達(dá)到4.886 pg/μL，而且引物對(duì)(aa-hsp-f1)/(aa-hsp-r2)存在于熱休克蛋白基因片段內(nèi)，高度保守，不僅特異性強(qiáng)而且靈敏度高，具有實(shí)際可操作性，可作為棗黑斑病田間發(fā)生動(dòng)態(tài)的追蹤檢測(cè)。

在棗黑斑病菌田間追蹤檢測(cè)研究中，發(fā)現(xiàn)棗黑斑病菌自5月開(kāi)始侵染棗樹(shù)葉片，隨著棗樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育，葉片發(fā)生率逐漸升高，7～8月達(dá)到侵染高峰，這一定與王蘭等研究結(jié)果一致。在針對(duì)不同時(shí)期采集的棗果樣品的檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)棗黑斑病菌在果實(shí)泛白期前便可檢測(cè)到，由此說(shuō)明病原菌在棗果泛白期已開(kāi)始侵染，但仍處于潛伏期，沒(méi)有明顯發(fā)病癥狀，直到8月開(kāi)始顯癥，9～10月開(kāi)始大量顯癥，這與部分研究報(bào)道結(jié)果一致。但在病害調(diào)查和樣品采集中，每年的7月在棗園樹(shù)勢(shì)較弱的棗樹(shù)葉片和果實(shí)上均可采集到一種癥狀不同與棗黑斑病癥狀(黑色圓斑)的棗樹(shù)病害，經(jīng)PCR檢測(cè)，病原依然是A.alternata，這還需要進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

通過(guò)對(duì)冬、春兩季棗園中病殘?bào)w及冠下表層土壤等樣本的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)棗黑斑病病菌在病果、病葉及冠下表層土壤中均可檢測(cè)出棗黑斑病的存在，其中病果檢出率最高，其次是病葉和冠下表層土壤，三者均為棗黑斑病的越冬場(chǎng)所。因此，及時(shí)針對(duì)越冬場(chǎng)所等傳染源進(jìn)行綜合處理，可作為預(yù)防和減輕病害發(fā)生程度的有效手段。此外，應(yīng)用建立的分子檢測(cè)技術(shù)開(kāi)展棗黑斑病的田間侵染動(dòng)態(tài)追蹤檢測(cè)，能為棗黑斑病的適時(shí)開(kāi)展高效防治提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

4.1 依據(jù)Margaret T. Mmbaga等報(bào)道的鏈格孢菌(A.alternata)的熱休克蛋白基因特異性引物對(duì)(aa-hsp-f1)/(aa-hsp-r2)，通過(guò)引物特異性驗(yàn)證和靈敏度檢測(cè)建立了阿克蘇地區(qū)棗黑斑病菌(A.alternata)的常規(guī)PCR分子檢測(cè)技術(shù)，該檢測(cè)技術(shù)特異性強(qiáng)，靈敏度高，具有實(shí)際可操作性，檢測(cè)靈敏度達(dá)到4.886 pg/μL ，可運(yùn)用于棗黑斑病田間發(fā)生動(dòng)態(tài)的追蹤檢測(cè)。

4.2 棗黑斑病菌自棗樹(shù)展葉期開(kāi)始侵染棗樹(shù)葉片，7～8月達(dá)到侵染高峰，后期葉片危害減輕。棗果在果實(shí)泛白前就已開(kāi)始受到棗黑斑病原菌侵染，但仍處于潛伏期，沒(méi)有明顯發(fā)病癥狀，在果實(shí)泛白期開(kāi)始顯癥，9～10月以后開(kāi)始大量顯癥，果實(shí)受害嚴(yán)重。

4.3 果實(shí)采收后棗黑斑病菌主要以病葉、病果等病殘?bào)w和表層土壤越冬，其中病果帶菌率最高，病葉和冠下表層土壤帶菌率較低，但仍然是棗黑斑病病原菌的越冬場(chǎng)所。