一種侵染紅棗葉片和果實的病原真菌鑒定

薩吉達木·艾則孜，麥合木提江·米吉提，趙志強，許泰百，郭慶元

(新疆農(nóng)業(yè)大學，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】棗(ZizyphusjujubaMill.)為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(Ziziphus)植物，我國是原產(chǎn)地，栽培歷史悠久[1]。紅棗是我國重要的特色果樹，也是新疆重要經(jīng)濟果樹。新疆紅棗種植面積約占全國總面積的1/3，已達4.7×105hm2[2]。隨著新疆紅棗種植面積的迅速擴大和栽培年限的延長，紅棗病害影響新疆紅棗的產(chǎn)量和品質(zhì)，查明紅棗病害種類，了解病害規(guī)律，高效控制紅棗病害的發(fā)生與危害對新疆紅棗產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有實際意義。【前人研究進展】據(jù)國外文獻報道，在棗的果實生長期Alternariachartarum、Aspergillusnanus、A.parasiticu、Helminthospriumatroolivaceum、Phomahessarensis和Stemphyliommavalparadisiacum可引起一些棗的果實病害；在果實儲藏期Alternariabrassicicola、Phomaspp.、Curvularialunat、Cladosporiumherbarum可引起一些棗果斑點性病害；此外，F(xiàn)usariumspp.、Nigrospqraoryzae、Epicoccumnigrum可引起棗果實腐爛，Entypellazizyphi、Hypoxylonhypomiltum、Patellariaatrata.侵染棗樹枝條[3]。國內(nèi)研究顯示，在2012～2013年對阿克蘇地區(qū)及南疆部分地區(qū)棗樹生長期的主要果實病害有縮果病、軟腐病、黑斑病、裂果病等；葉部病害有棗炭疽病、葉黑斑病、缺素癥及藥害等，枝干部病害有腐爛病、流膠病等10種病害[4]。其中，白劍宇等[5]通過分子鑒定，將棗黑斑病的病原菌鑒定為鏈孢霉屬鏈格孢(Alternariaalternata)。趙燕等[4]初步認定短小芽孢桿菌(BacilluspumilusWL.)是新疆紅棗縮果病的主要致病菌。白劍宇等[6]在國內(nèi)報道了棗樹褐斑病，病原菌鑒定為Nothophomaquercina。【本研究切入點】新疆紅棗病害的種類比較復雜，相關的鑒定和研究還比較不足。除了上述已查明病蟲害以外，近幾年在新疆阿克蘇地區(qū)局部紅棗上發(fā)現(xiàn)了一種引起花葉和果實畸形的病毒病(病原尚未確定)，并在花葉及畸形果上常有褐色斑點出現(xiàn)。經(jīng)過病害癥狀、田間發(fā)病特點及傳染性觀察初步判斷花葉、畸果癥狀為病毒引起，花葉及畸果上的褐色斑由病原真菌侵染所引起。2016年調(diào)查，有上述癥狀的受害果樹在阿克蘇部分地區(qū)已比較普遍，嚴重地塊果樹發(fā)生株率達100%；并有可能在更大區(qū)域蔓延。【擬解決的關鍵問題】研究主要針對與花葉、畸果癥狀相伴出現(xiàn)的真菌性褐色斑點病，通過病樣采集，病原菌分離，回接證病，病原菌的形態(tài)觀察及分子鑒定，確定病原種類，為病害的發(fā)病規(guī)律調(diào)查、病毒病的關系分析、病毒病的高效防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試病樣于2016年9月在新疆阿克蘇市機場附近棗果園采集。根據(jù)該危害的癥狀特點描述記載。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離及單孢純化

采用常規(guī)組織分離法和孢子蘸取法對采集的紅棗果實和葉片病樣進行病原菌分離，再用單孢純化方法獲得單孢菌株。

1.2.1.1 常規(guī)組織分離法

將有褐色病斑的葉片及果實用無菌水洗凈，晾干，在超凈臺上用75%乙醇浸潤2 min，在病健交界處切取約4 mm2組織，用2% NaClO液消毒5 min后，再用無菌水沖洗3次，置于濾紙上晾干，最后放在PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)5 d。

1.2.1.2 孢子蘸取法

田間采集病樣在低溫潮濕的環(huán)境保存15 d，待病斑處產(chǎn)生黑色小黑點(分生孢子器)并且溢出黑褐色黏狀物(分生孢子)。用接種針蘸取黑褐色黏狀物在PDA上進行25℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.1.3 單孢純化法

用接種針蘸取菌落上的分生孢子器中溢出的分生孢子，加入10 mL無菌水中，配制成的孢子懸浮液，并稀釋到103個/mL的濃度，用涂布器蘸取孢子懸浮液并涂布于WA平板培養(yǎng)基上，通過顯微觀察找到單個孢子并用接種針轉(zhuǎn)移至PDA平板培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)過程中再次通過顯微觀察確認并標記出單孢菌落，將其轉(zhuǎn)移至PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后保存于4℃冰箱備用。

1.2.2 回接證病

選取長勢一致的離體葉片和離體果實(直徑為1.5～2.0 cm)，用106個/mL的孢子懸浮液分別對其進行無傷接種和傷口接種，在室溫及室內(nèi)濕度下誘發(fā)病變，15 d完成觀察，記錄接種后出現(xiàn)的癥狀特點及分生孢子器特征。

(1)無傷接種

用75%的酒精棉球?qū)θ~片正面、背面及果實表面進行消毒處理，用毛筆蘸菌(106個/mL的孢子懸浮液)涂抹于葉片正面、背面及果實表面，并以無菌水為對照。

(2)傷口接種(針刺貼菌法)

對葉、果樣品進行同樣的消毒處理后置于玻璃板上，用注射針頭(?：0.23 mm)分別對葉面、葉背、葉脈及果實表面進行針刺，在每個接種點形成8～9個針刺傷，然后用事先制備的菌餅，將菌絲面朝向刺傷的接種部位，并覆蓋刺傷部位。對照用無菌PDA培養(yǎng)基。

1.2.3 病原菌形態(tài)觀察

選取典型菌株，將其轉(zhuǎn)入PDA平板上，25℃恒溫培養(yǎng)7 d后，觀察菌落、分生孢子器和分生孢子形態(tài)并分別測量分生孢子器和分生孢子大小。

1.2.4 病原菌分子鑒定

使用生工(上海)生物工程有限公司提供的新型植物基因組DNA快速抽提試劑盒(真菌)對多個單孢菌株分別進行病原菌基因組DNA的提取，以菌株的基因組DNA為模板，參照白劍宇等[6]的PCR反應體系及反應程序，采用ITS引物(ITS1/ITS4)進行PCR擴增；PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測確認后，委托新疆子琦生物技術有限公司進行測序。將菌株序列登錄GenBank網(wǎng)站，采用BLAST 軟件對測序結(jié)果進行同源性比較。并利用Mega軟件的UPGMA法和NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其與GenBank公布的近緣種的親緣關系，確定病原菌種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀與病原菌形態(tài)觀察

田間花葉和畸果癥狀多發(fā)生于新生枝條上，壞死褐斑多出現(xiàn)在有花葉癥狀的葉上和有畸果癥狀的果實表面。葉上形成褐色斑點或病斑，多數(shù)出現(xiàn)在葉脈上，容易造成葉脈褐色壞死，少數(shù)出現(xiàn)在葉脈間，呈褐色，圓形或不規(guī)則形；幼果受害，初不明顯，后期漸變?yōu)檫呇夭磺逦暮稚邏K，其上生多個小的突起；田間未見病征，但經(jīng)室內(nèi)保濕，葉斑和果斑上可產(chǎn)生黑褐色小粒點(分生孢子器)。圖1

a、b：病枝上的畸果、花葉癥狀；c、d：葉斑上產(chǎn)生的分生孢子器

a、b: The Deformed fruit、mosaic on the disease branches; c、d: The pycnidia produced on the leaf spot

圖1 棗樹病枝上畸果、花葉以及褐色葉斑
Fig.1 The deformed fruit、mosaic and brown leaf spots on the disease branches of jujube

通過分離純化得到3個單孢分離菌株，一株來自果實(菌株號：AKS117-F1)，2株來自葉片(菌株號：AKS117-L1、AKS117-L2)。這些菌株在PDA平板培養(yǎng)基上生長較快，菌落初期呈白色絲絨狀，氣生菌絲致密，短絨毛狀，后變?yōu)楹稚梁诤稚浔趁嬗忻黠@輪紋；分生孢子器生于氣生菌絲下，埋生或半埋生，初為褐色，成熟時變黑褐色，有孔口，卵形或近球形，聚生或散生，菌落中央多而密，邊緣較分散，大小為(88.7×125.3) μm～(194.6×233.1) μm(平均為(108.2～214.8) μm，n = 30)；鏡檢觀察時分生孢子從孔口成串外溢，大多數(shù)分生孢子呈長橢圓形，無色，單細胞(2.7～3.8) μm×(7.2～9.5) μm(平均為(3.4×8.5) μm，n = 50)。圖2

根據(jù)《莖點霉屬真菌的鑒定手冊》[7]中記載的頭狀莖點霉的形態(tài)特征和E. K. Ligoxigakis.等[8]描述的P.glomerata形態(tài)特征基本一致。圖2

e: 菌落正面; f: 菌落背面; g: 分生孢子器; h: 分生孢子

e：Colony of pathogen; f: The back of the Colony of pathogen; g: Pycnidia of the pathogen; h: Conidia of the pathogen

圖2 病原菌形態(tài)特征
Fig.2 Morphological characteristics of the pathogens

2.2 回接證病

用3個來自病葉和病果的分離菌株分別對離體葉、果進行的接種試驗結(jié)果表明，進行無傷接種的葉、果均未發(fā)病；而傷口接種的葉、果均有發(fā)病，對照無癥狀。接種3 d后，可見果實接種點開始出現(xiàn)壞死、葉面和葉脈的不太明顯；7 d后，果實病斑擴大，侵染部位開始凹陷，葉上出現(xiàn)褐色病點，并開始擴展，且明顯可見葉脈上病斑較葉脈間病斑擴展更快；15 d后，果實病斑繼續(xù)擴大，各接種點病部相連，組織壞死，形成更大凹陷壞死斑，病部生褐色至黑褐色分生孢子器；葉片病斑擴展緩慢，但葉脈壞死部出現(xiàn)少量褐色至黑褐色分生孢子器。回接后的一系列癥狀表現(xiàn)與田間病狀及病樣誘發(fā)病征有很大的相似性，從接種葉、果病部再分離所獲得的病菌特征與接種用菌相同。確定3個分離菌株侵染紅樹葉片和果實引起褐色壞死病斑的病原菌。圖3

2.3 分子生物學鑒定

使用引物ITS1/ITS4對3個菌株的rDNA進行PCR擴增和電脈分析得到約500 bp擴增條帶，經(jīng)測序均得到大小517、523和529 bp的rDNA-ITS序列，并向GenBank提交了菌株AKS117-F1的rDNA-ITS擴增片段序列(收錄號為MG372318)。將該序列與Gen Bank中相關菌株的ITS序列進行同源性比較，結(jié)果表明，3個分離菌株之間的相似度為100%，并與Peyronellaeaglomerata(GenBank登錄號：AB470906、KT192373等)和Phomaglomerata(GenBank登錄號：EU273521)相似度達到99%。圖4，圖5

i：接種3 d后的果實癥狀；j：接種7 d后的果實癥狀；k：接種15 d在果實上產(chǎn)生的分生孢子器；l：接種7 d后的葉片

i: Symptom the fruit of 3 days after inoculation; j: Symptom the fruit of 7 days after inoculation; k: Pycnidia on the fruit of 15 days after inoculation; l: Symptom the leaf of 7 days after inoculation

圖3 葉片和果實上人工接種癥狀
Fig.3 Symptoms of artificial inoculation on leaves and fruits

M：2000D ladder marker；1-2：AKS117-F1；:3-4：AKS117-L2；5：AKS117-L2；CK：陰性對照;

M: 2000D ladder marker; 1-2: AKS117-F1; 3-4: AKS117-L2; 5: AKS117-L2; CK: negative control

圖4 病原菌ITS序列PCR擴增結(jié)果
Fig.4 The PCR amplification product of ITS sequence of pathogens

注：括號中為相關菌株在GenBank中的登錄號，分支處數(shù)值表示自舉值。尺標表示每個核苷酸位點上的0.1替換值

Note： Numbers in parentheses represent the accession numbers of the related isolates in Gen Bank，the numbers in each branch points denote the percentages supported by bootstrap. Scale bar represents 0.1 substitutions per nucleotide position

圖5 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.5 Phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequences

3 討 論

Peyronellaeaglomerata(Corda) Goid. ex Togliani與Phomaglomerata(Corda) Wollenw. & Hochapfel為同物異名[8]，其中文譯名為頭狀莖點霉。迄今，關于該菌作為植物病原菌的報道有很多，可為害近百種植物，常造成絲葵枯萎病[8]、無花果葉斑病[9]、牡丹枝枯病[10]、五味子樹葉斑病[11]、黃瓜葉斑病[12]、葡萄莖枯病[13]、開心果的枝枯病[15]、藤蔓植物花枯病[14]及多種植物(草坪早熟禾[16]、豌豆[17]、馬鈴薯[18]、山茱萸[19])的葉枯病等。根據(jù)所掌握的資料，頭狀莖點霉在棗上的侵染為新寄主記錄。

研究從多次重復回接過程中發(fā)現(xiàn)，病原菌對健康組織的侵染力較弱，主要從傷口侵入，引起褐色壞死斑，雖與田間的花葉癥狀及畸果癥狀有較強的共存性，但不是引起花葉和畸果癥狀的病原，而是與花葉病混合發(fā)生的病害，且與花葉病有著某種非必然的聯(lián)系。目前已有棗花葉病及其病原和傳媒的相關報道，但花葉病與頭狀莖點霉的侵染有何關系值得研究。一種簡單的推論是花葉病削弱了葉果抗病性，致使弱侵染的頭狀莖點霉較易侵染。此外，頭狀莖點霉是否可以帶毒、傳毒，花葉病毒與頭狀莖點霉之間是否存在協(xié)同侵染等問題有待進一步的研究。

4 結(jié) 論

從病樣上分離獲得的主要分離物接種到離體葉和幼果后出現(xiàn)與直接采集到的病樣癥狀基本相似的壞死病斑，確定其為棗葉、果褐色壞死斑的病原菌；病原菌的分生孢子器平均大少約108.2～214.8 μm，分生孢子平均大少約(3.4×8.5) μm，與P.glomerata的形態(tài)特征基本相似。使用引物ITS1/ITS4對3個菌株的rDNA進行PCR擴增，經(jīng)測序均得到大小517、523 和529 bp的rDNA-ITS序列。將該這些序列與Gen Bank中相關菌株的ITS序列進行同源性比較，其相似度與PeyronellaeaglomerataSynonymPhomaglomerata均達到99%。結(jié)合形態(tài)觀察及分子鑒定將該病原菌鑒定為頭狀莖點霉(Peyronellaeaglomerata(Corda) Goid. ex Togliani)。其分類歸屬為真菌界，半知菌類，腔孢綱，球殼孢目，莖點霉屬。