黑曲霉ZD利用棉花秸稈固體發酵產纖維素酶條件優化

郭凱，崔衛東，王寧，侯敏，包慧芳，房世杰

(1.新疆農業科學院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農業科學院科研管理處，烏魯木齊 830091；3.新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】新疆地區棉花種植面積占據我國的大半，且產量頗豐，由此也產生大量棉花秸稈浪費現象[1]。目前對于棉花秸稈處理采取當地焚燒和還田處理，對于當地土壤理化性質和微生物菌群造成嚴重破壞，因此，對于棉花秸稈這種可再生資源的利用，不僅可以解決環境破壞和資源浪費問題，還可以增加農民收入[2]。通過對棉花秸稈營養成分的測定，發現棉花秸稈的粗蛋白含量比小麥、水稻和玉米秸稈要高[3]。黑曲霉是公認的安全菌株，生長速度快，營養要求低，且產生的纖維素酶，酶系全面，是較合適利用棉花秸稈作為發酵基質的生產菌株[4]?！厩叭搜芯窟M展】固體發酵與液體發酵相比，具備了發酵培養基原料來源廣泛，環境污染少，不需要嚴格的無菌條件，投資少，易操作的優點。固體發酵產纖維素酶的研究有很多，在菌種選擇和發酵基質上種類也很多。伍紅等[5]利用甘蔗渣和麩皮作為發酵基質，對黑曲霉固態發酵產纖維素酶活進行優化。張寧等[6]選擇麩皮和玉米秸稈作為發酵基質，通過麩皮和玉米秸稈的配比，料液比，發酵時間，發酵溫度和發酵起始pH對發酵產酶的影響，對里氏木霉固體發酵產纖維素酶進行優化?！颈狙芯壳腥朦c】利用可再生資源棉花秸稈作為發酵基質，運用高產纖維素酶菌株黑曲霉進行固體發酵，優化發酵條件，提高纖維素酶活?！緮M解決的關鍵問題】通過對棉花秸稈和玉米粉的質量比、發酵時間、接種量、加水量和不同pH值的單因素試驗，再通過PB試驗設計篩選出主要因素，通過爬坡試驗設計中心點，最后借助響應面對發酵條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌種

黑曲霉ZD，由新疆農業科學院微生物應用研究所分離，現保存于新疆農業科學院微生物應用研究所菌保室。

1.1.2 樣品

五家渠種植棉花采摘后產生的棉花秸稈，經粉碎機粉碎后過40目篩。

1.1.3 培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g、瓊脂15～20 g、葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH值自然。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸0.5 h，然后用紗布過濾，再加糖，融化后補足水至1 000 mL。121℃、30 min滅菌(液體培養基不用加瓊脂)。

斜面培養基：PDA培養基。

種子培養基：PDA液體培養基[7]。產酶初始液體培養基：可溶性淀粉 1 g/100 mL，蛋白胨0.5 g/100 mL，硫酸鎂0.05 g/100 mL，磷酸氫二鉀0.1 g/100 mL。

初始固體發酵培養基：棉花秸稈20 g，玉米粉10 g，硫酸銨5 g，加水量50%，攪拌混勻后，裝入500 mL三角瓶，121℃滅菌30 min，然后接入5%菌液。

1.2 方 法

1.2.1 固體發酵粗酶液制備

從三角瓶中取出10 g(接入5%菌液，已經發酵7 d的培養物作為對照)發酵培養物，加10倍于酶曲質量的無菌水，30℃,150 r/min搖床震蕩浸提1 h，使酶蛋白充分釋然，然后用八層紗布過濾，取濾液于4℃、8 000 r/min下離心10 min，上清即為粗酶液[8-9]。

1.2.2 酶活檢測

以羧甲基纖維素鈉酶活為測定指標，取4支25 mL刻度試管，其中3支加入2 mL羧甲基纖維素鈉溶液和0.5 mL粗酶液，然后50 ℃水浴加熱30 min。另外1支先加入0.5 mL粗酶液，沸水浴5 min，使酶完全失活，再加入2 mL羧甲基纖維素鈉溶液作為對照。將4支試管同時加入3 mL DNS溶液，沸水浴5 min，用蒸餾水定容至25 mL，再用紫外分光光度計在540 nm下測吸光值(A540)。酶活力計算以每1 min產生1 μmol還原糖定義為1個酶活力單位(U)[10-11]。

1.2.3 標準曲線制備

葡萄糖標準液制備：稱取無水葡萄糖1 g(精確至0.001 g)加檸檬酸鹽緩沖液定容至100 mL。

量取標準葡萄糖溶液0、2、4、6、8、10 mL，用檸檬酸鹽緩沖液定容至50 mL,配成濃度為0～2 mg/mL的標準系列。

分別吸取葡萄糖標準系列溶液各1 mL于25 mL容量瓶中，各加2 mL水和3 mL DNS溶液沸水浴5 min，冷卻至室溫，用水定容至25 mL，在540 nm波長下測吸光值(OD值)，并用葡萄糖含量(mg)與測定值(OD)作圖，即為標準曲線。Y=0.009 8x-0.013 8(R2=0.998 7)。

式中：Y為相當葡萄糖含量/(mg/mL)；x為酶解反應產物溶液經顯色后所測的OD540nm值。說明在葡萄糖質量濃度范圍內線性關系較好[12-13]。

1.2.4 單因素試驗設計

分別對棉花秸稈與玉米粉的質量比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)，發酵時間(7、15、20、30、40 d)，接種量(5%、10%、15%)，加水量(50%、55%、60%、65%)和pH值(3、4、5、6、7)進行單因素試驗。每個處理3個重復，在基礎固體發酵培養基下調節各個參數，確定每個影響因素的最適條件。

1.2.5 Plackett-Burman(PB)設計

分別選取以上5個因素的高低2個水平，通過Design-Expert軟件選用Factors=5，Runs=12的PB設計，以羧甲基纖維素酶(CMCase)活力響應值。通過比較各因素的顯著性水平，篩選出對酶活力影響較為顯著的因素。

1.2.6 最陡爬坡試驗

根據PB試驗及其分析結果設計最陡爬坡試驗，即對顯著因素進行梯度設計，根據顯著因素一次項的系數，正系數逐漸遞增確定變化范圍；負系數逐漸遞減確定變化范圍，以此來確定中心點。其余不顯著的因素根據PB分析模型中系數的正負進行選取，正系數取高水平，負系數選取低水平。

1.2.7 Box-Behnken中心組合設計

逼近最大酶活區后，進行Box-Behnken中心組合試驗設計，以試驗結果擬合建立描述響應量(酶活)與自變量(影響酶活的顯著性因素)關系的多項式回歸模型。

1.2.8 統計分析

所有試驗每個處理做4個重復，用Origin軟件做數據誤差分析，Design-Expert對PB試驗和中心組和設計進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

研究表明，在棉花秸稈和玉米粉的質量比為4∶1，發酵時間為40 d，接種量為10%，含水量為60%，pH值為4時，黑曲霉利用棉花秸稈固體發酵的產酶能力最優，因此，對篩選出來的水平進行PB設計。圖1

圖1 各因素下黑曲霉固體發酵產酶變化
Fig.1 Effects of various factors on the production of enzymes by Aspergillus niger solid fermentation

2.2 PB試驗設計和優化

根據前期試驗結果，設計Plackett-Burman試驗來篩選影響黑曲霉利用棉花秸稈固體發酵產酶的主要因素，每組試驗設4個重復(結果均為4個結果的平均值)。PB試驗設計及結果見表1和表2，統計分析結果見表3。由表3的方差統計分析，模型的P值為0.037 1<0.05，模型選擇正確。由變量顯著性P值大小可知，棉花秸稈與玉米粉的質量比(P=0.039 4)，接種量(P=0.043 4)，含水量(0.015 9)P值均小于0.05，說明棉花秸稈與玉米粉的質量比，接種量和含水量對黑曲霉利用棉花秸稈固體發酵產酶影響顯著，且含水量>碳氮比﹥接種量。其他因素對黑曲霉利用棉花秸稈固體發酵產酶影響不顯著，因此，選取碳氮比，接種量和含水量進一步優化。表1～3

表1 Plackett-Burman試驗因素水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

因素Factor水平 Level-11棉稈與玉米粉質量比Mass ratio of cotton stalk to corn flour(X1)4∶15∶1發酵時間Fermentation time(X2)40 d50 d接種量Inoculation rate(X3)10%12.5%含水量Water content(X4)60%65%pH值pH value(X5)34

表2 PB試驗設計及其結果
Table 2 Experimental design and responses of Plackett-Burman design

試驗號Test number棉稈與玉米粉質量比Mass ratio of cotton stalk to corn flour發酵時間Fermentation time接種量Inoculation rate含水量Water contentpH值pH value酶活(U/mL)Enzyme activity1-1111-1254.334211-111258.9303-1-1-11-1262.3454111-1-1298.3205-111-11286.2206-11-111250.339711-1-1-1270.5548-1-11-11273.2209-1-1-1-1-1266.201101-111-1277.234111-1-1-11285.364121-1111279.242

表3 PB試驗方差
Table 3 ANOVA analysis for PB experimentation

來源Source平方和Sum of square自由度df均方Mean squareF值F valueP值p-value模型 Model1 804.4555360.8915.033 8430.037 1X1-棉稈與玉米粉質量比 Mass ratio of cotton stalk to corn flour493.185 41493.185 46.879 1340.039 4X2-發酵時間 Fermentation time51.551 37151.551 370.719 0580.429 0X3-接種量 inoculation rate466.627 41466.627 46.508 6930.043 4X4-含水量 Water content791.570 11791.570 111.041 120.015 9X5-pH值 pH value1.520 83211.520 8320.021 2130.889 0殘差 Residual430.157 7671.692 95總值 Total2 234.61311

2.3 最陡爬坡試驗

根據PB試驗結果設計最陡爬坡試驗設計路徑，其步長和爬坡方向，可以根據PB試驗中影響因素系數正負來決定，按0.5的步長增加棉稈與玉米粉的比例，按1%的步長增加接種量，按2.5%的步長減少含水量。其余因素均取單因素試驗的結果。檢測固體發酵酶活的變化，每組做4個重復(表中結果為平均值)。當棉稈與玉米粉質量比為4∶1，接種量為10%，含水量為60%時，黑曲霉利用棉花秸稈固體發酵產酶的酶活最高，因此，選擇第一組作為中心點，進行下一步優化試驗。表4

表4 最陡爬坡試驗及結果
Table 4 Steepest ascent path design and result

試驗號Test number棉稈與玉米粉質量比X1 Mass ratio of cotton stalk to corn flour接種量X3 inoculation rate含水量X4 Water contentCMC酶活(U/mL)Enzyme activity14∶110%60%299.12924.5∶111%57.5%295.39835∶112%55%284.39045.5∶113%53.5%290.33056∶114%50%294.204

2.4 Box-Behnken中心組合設計

采用Box-Behnken法進行中心組合試驗設計，非顯著因素采用單因素試驗結果，以固體發酵的CMC酶活為響應值，采用Facotors=3，Runs=17的中心組合設計，每組試驗做4個重復(表中結果為平均值)。Box-Behnken中心組合試驗設計和結果見表5和表6。通過中心組合試驗設計，對數據進行二次多元回歸擬合，得到二次多項式方程：

Y=304.867 60+0.547 88X1+2.088 38X3+3.361 00X4-6.612 50X1X3+3.750 75X1X4-6.957 75X3X4-11.826 55X12-4.149 05X32-5.470 80X42。表5，表6

表5 中心組和試驗設計因素水平Table5Centergroupandexperimentaldesignfactorlevel

因素Factor水平 Level-101棉稈與玉米粉質量比X1Mass ratio of cotton stalk to corn flour 3∶14∶15∶1接種量X2Inoculation rate8%10%12%含水量X3Water conten55%60%65%

表6 中心組和設計方案及結果
Table 6 Central composite design and results

試驗號Test number因素 Factor棉稈與玉米粉的比例Mass ratio of cotton stalk to corn flour 接種量Inoculation rate含水量Water contenCMC酶活(U/mL)Enzyme activity1000307.4592-10-1288.3083101294.3344-110296.7805-1-10280.3386000305.2097110284.22181-10294.2299000306.90210-101285.30711011295.330120-1-1281.2501310-1282.3321401-1300.30215000303.564160-11304.10917000301.204

研究表明，模型的P值為0.000 1遠小于0.01，極顯著，說明方程擬合度較好；失擬項反應的是模型與試驗數據的相符情況，P值越大，說明模型與試驗數據越相符合，失擬項的P值=0.639 4﹥0.05，影響不顯著，模型選擇正確。從表中可以看出，X1X3的P值=0.000 8，X1X4的P值=0.014 8，X3X4的P值=0.000 6，碳氮比和接種量的交互作用極顯著，接種量和含水量之間交互作用極顯著，碳氮比和接種量交互作用為顯著，說明每個因素之間互相影響，共同促進黑曲霉利用棉花秸稈固體發酵產酶。表7

研究表明，復相關系數R2=0.973 6，說明模型可以解釋97.36%試驗所得酶活力變化，預測值和實際值之間具有較高的相關性；校正后的R2=0.939 7，說明模型可信度較高，能夠很好表明試驗結果；Y的變異系數CV=0.79，數值較低，說明試驗精確度較高，操作可信。信噪比=14.084，數值較大，說明試驗數據有效值遠遠大于無效值。表8

表7 回歸方程方差
Table 7 ANOVA analysis for regression equation

方差來源Source平方和Sum of square自由度df均方Mean squareF值F valueP值P value模型Model1 408.759156.5328.70.000 1X1-棉稈與玉米粉質量比Mass ratio of cotton stalk to corn flour2.412.40.440.528 2X3-接種量inoculation rate34.89134.896.40.039 3X4-含水量Water conten90.37190.3716.570.004 7X1X3174.91174.932.070.000 8X1X456.27156.2710.320.014 8X3X4193.641193.6435.510.000 6X12588.911588.91107.99< 0.000 1X3272.48172.4813.290.008 2X42126.021126.0223.110.002殘差 Residual38.1775.45失擬項 Lack of Fit12.0834.030.620.639 4純誤差 Pure Error 26.0946.52總值 Total1 446.9216

表8 模型可信度
Table 8 Fit statistics for Y

標準差 Std.Dev2.34復相關關系數 R2R-Squared0.973 6均值 Mean294.78校正后的R2 Adj R-Squared0.939 7Y的變異系數C.V.(%)0.79預測復相關系數R2 Pred R-Squaerd0.838 2預測誤差平方和 Press Sum of square234.08信噪比 Adeq Precisior14.084

2.5 驗證試驗

利用Design-Expert軟件對回歸模型畫出各個因素對黑曲霉利用棉花秸稈固體發酵產酶交互作用的等高線圖和響應面。等高線圖反映因素間的交互作用，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著。研究三張等高線圖均為橢圓形代表相互作用顯著，碳氮比和接種量對固體發酵產酶交互作用顯著；碳氮比和含水量對固體發酵產酶交互作用顯著；接種量和含水量對固體發酵產酶交互作用顯著。再由圖和軟件對方程式進行分析和優化，確定最優試驗點編碼X1,X3,X4(0.44,-0.94,1.00),即棉花秸稈與玉米粉的質量比為4.4∶1，接種量為8.12%，含水量為65%。此條件下該模型預測黑曲霉利用棉花秸稈固體發酵產酶的酶活為306.006 U/mL。

由于以上最佳條件未在驗證的17組試驗中，需要進一步驗證。在優化后的培養條件下，即棉花秸稈和玉米粉的質量比為4.4∶1，接種量為8.12%，含水量為65%，發酵時間40 d，pH值為4，然后測定CMC酶活，共做了4個重復，將未優化發酵條件(棉花秸稈和玉米粉的質量比為4∶1，發酵時間20 d，接種量5%，含水量50%，pH值為7)的試驗結果作為對照，同樣做了4個重復，平均值為207.496 U/mL。在預測的最優條件下，測得CMC酶活為310.885 U/mL(4次所測平均值)，與預測值比較接近，且比未優化的發酵條件下酶活提高了49.8%。圖2～4

圖2 碳氮比和接種量對CMC酶活交互作用的等高線圖和響應面
Fig.2 Response surface plot and contour plot for the interaction effect of Ratio of carbon

andnitrogenandinoculumamountonenzymeactivityofCMC

圖3 碳氮比和含水量對CMC酶活交互作用的等高線圖和響應面
Fig.3 Response surface plot and contour plot for the interaction effect of Ratio of carbon and nitrogen and water content on enzyme activity of CMC

圖4 接種量和含水量對CMC酶活交互作用的等高線圖和響應面
Fig.4 Response surface plot and contour plot for the interaction effect of inoculum amount and water content on enzyme activity of CMC

3 討 論

3.1 固體發酵產纖維素酶菌種選擇很重要，要求菌種易生長繁殖，能夠可以很好地利用廢棄物作為生長繁殖及產酶的基質。研究以黑曲霉為發酵菌株，黑曲霉為曲酶屬真菌常見菌種，高產纖維素酶菌種之一，且產纖維素酶酶系全面，是重要的發酵工業菌種，且黑曲霉具有裂解大分子有機物的能力，因此，選取黑曲霉發酵棉花秸稈，是很好的研究方向。宋曉妍等[14]利用玉米秸稈和麩皮，以高產纖維素酶綠色木霉為發酵菌株，羧甲基纖維素鈉酶活力達到72.5 U/g；吳發遠[15]研究了康氏木霉利用稻草和麩皮進行固體發酵，所產纖維素酶：羧甲基纖維素鈉酶活為321.64 U/mL，濾紙分解酶活力為59.58 U/mL；林蒙蒙等[16]利用白腐真菌進行固體發酵產纖維素酶，羧甲基纖維素鈉酶活達到27.15 U/g，和濾紙分解酶活力為3.16 U/g。

3.2 除了菌種選擇，固體發酵條件像發酵時間、發酵基質和輔料的配比、接種量、含水量、pH值和輔料對固體發酵產酶有著比較大的影響。固體發酵過程中發酵基質和輔料配比非常重要，合適的比例有利于固體發酵產酶，過高或過低有可能產生對于菌種生長不利的物質，抑制微生物生長繁殖產酶；也有可能產生氨氣，損失大量氮源影響微生物代謝，導致產酶降低。含水量的多少也非常重要，調節合適基質含水量可以給微生物生長提供良好的氣體交換、熱傳遞和營養供應，過低或過高的水分都會影響微生物的正常生長進而降低產酶量。接種量對固體發酵影響也很重要，采用較大的接種量可以縮短菌絲繁殖達到高峰的時間，使產物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機會。但接種量過大會引起溶氧不足，影響產物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經濟，過小會延長培養時間。靖德兵等[17]應用雙溫度培養法進行康氏木霉固體發酵生產纖維素酶，在自然補給氧氣，發酵培養基以50%稻草粉，8%(NH4)2SO4，42%麩皮，加固體物質的4.9倍的水，再配以少量吐溫80，保持環境濕度約60%，發酵72 h，提高了纖維素酶活力。袁麗環[18]以玉米秸稈為原料，利用菌株固體發酵生產纖維素酶，確定固體發酵生產纖維素酶的最佳工藝參數：8%接種量，30℃溫度下66 h，酶活達到142.55 U/mL。張輝等[19]研究嗜熱側孢霉固體發酵產纖維素酶，在最適合產酶條件下：麩皮∶甘蔗渣(1∶2)50 g，(NH4)2SO41 g，K2HPO40.1 g，MgSO40.03 g，60%含水量，pH 5.5，培養溫度45℃，測得羧甲基纖維素鈉酶活320.04 U/mL，濾紙分解酶活力38.65 U/mL，棉花酶活力180.31 U/mL。

4 結 論

4.1 通過單因素試驗，對影響黑曲霉利用棉花秸稈固體發酵產纖維素酶的5種發酵條件的顯著性進行了研究，再利用Plackett-Burman試驗設計，經方差分析，確定影響黑曲霉利用棉花秸稈固體發酵的主要因素碳氮比，接種量和含水率，得出顯著性順序為含水率﹥棉花秸稈與玉米粉的質量比﹥接種量。

4.2 通過最陡爬坡試驗，根據PB試驗設計結果，設計步長和爬坡方向，確定棉花秸稈和玉米粉的質量比4∶1，接種量10%和含水率60%為中心點；再利用Box-Behnken試驗設計的方法，以爬坡試驗的結果為中心點，通過響應面優化確定了黑曲霉利用棉花秸稈固體發酵產纖維素酶的最佳發酵條件：棉花秸稈與玉米粉的質量比為4.4∶1，接種量8.12%，含水率65%，發酵時間40 d和pH值4。固體發酵酶活達到310.885 U/mL，比未優化條件下的酶活207.496提高了49.8%。