金福菇多糖對衰老大鼠p16基因表達影響

張春軍 董凱 董琦 宋潔 曾海 楊國宏

【摘要】 目的：探討金福菇多糖對衰老大鼠p16基因表達的影響。方法：實驗材料選用清潔級SD大鼠25只，將實驗動物隨機分成5組，每組5只。分別為正常對照組、衰老模型組、高劑量治療組、中劑量治療組、低劑量治療組，采用皮下注射D-半乳糖方法建立衰老大鼠模型，除正常對照組外，分別給予金福菇多糖溶液灌胃治療，采用逆轉錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）檢測各組大鼠心臟組織p16 mRNA的表達情況。結果：衰老模型組小鼠p16基因表達明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05），給予金福菇多糖治療后p16基因相對表達均明顯低于衰老模型組小鼠，其中中劑量組最低，三組比較差無統計學意義（P>0.05）。結論：金福菇多糖可有效降低p16 mRNA的表達，從而起到抗衰老的作用，值得進一步研究。

【關鍵詞】 金福菇多糖； 衰老； p16

【Abstract】 Objective：To explore the effect of Jin Fu Mushroom Polysaccharide on p16s gene expression of aging rats.Method：A total of 25 clean grade SD rats were chosen，the animals were randomly divided into 5 groups，5 rats in each group（the normal control group，aging model group，high-dose treatment group，middle-dose group，small-dose treatment group），using the method of subcutaneous injection of D-galactose aging rat model was established，in addition to the normal control group，another groups were given different doses of Jin Fu Mushroom Polysaccharide treatment，the p16 gene expression of rats was detected by reverse transcription PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）.Result：The p16 gene expression of aging model group was obviously higher than that of the normal control group，the difference was statistically significant（P<0.05），after giving Jin Fu mushroom polysaccharide，the p16s gene expression was lower than those of in aging model group，in which the lowest dose group，but there was no significant difference among three groups（P>0.05）.Conclusion：Jin Fu Mushroom Polysaccharide can effectively reduce the p16 mRNA expression，is likely to be the mechanism of heart in the rat model of aging，is worth of further study.

【Key words】 Jin Fu Mushroom Polysaccharide； Aging； p16

First-authors address：Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.24.005

隨著生物醫學的發展，人們對食用菌多糖及其衍生物的活性有了更深入的了解，發現食用菌多糖具有一定的輔助醫療作用，如抗菌、抗病毒、抵抗缺氧環境、抗衰老、抗腫瘤、降血脂等，是保健性食品及抑癌藥物的重要原料來源[1-3]，被專業人士所認可。近年來，國內外關于食用菌研究很多，但多局限于食用菌培養條件的優化及其生物學特性[4-5]，

而關于金福菇多糖抗衰老的研究較少。衰老與基因有密切關系，被某些基因所控制，隨著年齡的增加，多數原癌基因表達或活性降低，使得機體組織和器官發生漸進性退行性變，直到死亡，這是所有生物的特征[6]。細胞衰老是器官功能乃至整個機體功能衰老的主要表現[7]。p16基因是一種抑癌基因，在細胞衰老過程中起著重要的作用[8]。研究表明p16基因作用誘導細胞老化，抑制細胞無限分裂，從而維持細胞周期穩態[9-10]，金福菇是一種分布于熱帶和亞熱帶的食用菌，具有豐富營養價值，且具有多種生物活性，近年來，多個課題組成員對金福菇多糖及生物活性進行研究，金福茹多糖具有很好的抗氧化活性[11-12]。金福菇多糖具有抗氧化活性、抗腫瘤、抗疲勞、調節免疫等作用[13]。本實驗探討金福菇多糖對衰老大鼠p16基因表達的影響，從而能夠抑制大鼠衰老的作用，旨在對金福菇多糖抗衰老的生物學活性進行研究，為抗衰老的藥物研究提供可靠依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料 選用清潔級SD大鼠25只，周齡8～9周，體重160～180 g，由牡丹江醫學院動物實驗中心提供，合格證號SCXK（黑）（2017-0001）金福菇多糖采用95%乙醇脫脂、水提取、濃縮、醇沉淀、經除蛋白、透析以及真空干燥等程序提取分離純化，多糖含量大于95%，D-半乳糖為上海試劑二廠生產，RT-PCR引物為上海生工合成。

1.1.2 儀器 DK-S26型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；紫外-可見光光度計（上海光電研究所）；ELGA超純水機（Veolia Water System公司）；3K15高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；實時定量PCR儀（美國通用生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及分組 利用D-半乳糖破壞體內氧化酶活性，形成更多氧化產物引起細胞損傷，導致機體功能衰退的原理[14-15]，進行大鼠衰老模型的制備。在牡丹江醫學院動物實驗中心領取大鼠25只，首先將所有實驗動物隨機分成正常對照組、衰老模型組、大劑量治療組、中劑量治療組、小劑量治療組5組。正常對照組每天給予注射等量生理鹽水，1次/d，共42 d。給予其他組實驗動物頸背部皮下注射D-半乳糖100 mg/kg，1次/d，連續給D-半乳糖42 d，建立亞急性衰老大鼠模型。同時每日以400、200、100 mg/kg金福菇多糖水溶液分別給予大、中、小劑量治療組進行灌胃，正常對照組和衰老模型組給予等劑量的生理鹽水，治療周期為6周。

1.2.2 采集標本及測定 5組大鼠于43 d后，最后一次給藥4 h后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，取出大鼠的腦海馬區組織50～100 mg，采用液氮冷凍后放入研缽，加入1 mL RNA提取試劑（Trizol）進行充分研磨，然后抽提勻漿移入1.5 mL的Ep管中，常溫放置5 min；每管加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置2～3 min；4 ℃離心機12 000 r/min離心5 min；取水相后加入0.5 mL的異丙醇，混勻后室溫放置10 min。4 ℃離心機12 000 r/min離心5 min，去除上清液，加入1 mL 75%乙醇，搖勻后，4 ℃離心機7 500 r/min離心5 min，去除上清液，剩余部分倒置于超凈工作臺下干凈濾紙上，自然干燥10 min，加入20 μL DEpC水混勻，置于低溫冰箱保存。

1.2.3 檢測p16mRNA表達 根據Gen Bank提供的p16和內參β-actin的 mRNA序列，應用Primer 6.0軟件設計引物，其序列由Invitrogen公司合成。采用實時定量-逆轉錄聚合酶鏈反應進行基因片段擴增并定量，p16基因的上游引物為5-CTCCTTGGCTTCATTCTGG-3，下游引物為5-CTCCCTCCCTCTGCTAACCT-3，擴增片段為342 bp；PCR擴增產物為207 bp；RT-PCR反應條件為：Trizol方法提取RNA，用反轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄CDNA第一鏈，反應體積20 μL，37 ℃ 孵育15 min，85 ℃ 5 s終止反應，滅活反轉錄酶，逆轉錄產物4 ℃保存。95 ℃，5 s，59 ℃，20 s，72 ℃，20 s，40循環。進行瓊脂糖凝膠電泳檢測及凝膠成像系統掃描分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

將RNA提取，用A 260/A 280的比值均大于1.8的RNA樣品提取后，通過紫外線分光度計鑒別其濃度和純度，結果提取的總DNA質量和純度都很好，可用于RT-PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin為參照，圖像分析結果顯示：衰老模型組小鼠p16基因表達明顯高于正常對照組，見圖1。金福菇多糖可有效降低大鼠海馬p16基因mRNA表達，給予金福菇多糖治療后p16基因相對表達明顯降低，衰老模型組p16基因[（0.205±0.018）μg/mL]表達明顯增加，與正常對照組[（0.167±0.013）μg/mL]相比，衰老模型組大鼠p16基因表達明顯增加（P<0.05）；與衰老模型組對比，小、中、大劑量治療組p16基因表達[（0.176±0.009）、（0.177±0.016）、（0.175±0.009）μg/mL]均明顯降低，其中中劑量組最低，但三組比較差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

隨著現代醫學飛速發展，人們對衰老機制有了深層次的認識，提出了許多學說，如：氧自由基占主導地位學說，其認為造成機體衰老的原因是構成生物的基本單位細胞衰老，隨著生物年齡的增長，平衡系統逐漸失衡，使得自由基過量而引起的生物衰老[16-17]。端粒假說，認為染色體的端粒是維持染色體結構完整性和穩定性的，隨著連續的細胞分裂，端粒逐步縮短，甚至完全丟失，細胞隨之發生老化并喪失分裂能力而死亡，這是老年人染色體端粒長度明顯低于年輕人的原因[18]。總體說來衰老是許多病理、生理和心理過程綜合作用的必然結果，是個體生長發育最后階段的生物學心理學過程，細胞衰老時，可有效抑制細胞的有絲分裂，刺激連鎖反應產生RB蛋白的磷酸化，從而維持衰老細胞形成不可逆性的生長停滯狀態[19]。而衰老受某些基因的控制，其中p16基因是細胞衰老遺傳控制程序中的重要環節，當細胞衰老時，p16基因的mRNA轉錄及蛋白表達水平會明顯增高，目前認為：其主要通過p16-cyclinD/CDK-RB途徑調控細胞周期，細胞增殖周期的調控與個體發育、分化、生長、衰老及癌變均有密切關系[20]。金福菇多糖對大鼠海馬p16基因mRNA表達對治療細胞衰老具有臨床意義，研究表明金福菇多糖可有效減少小鼠皮膚內的羥脯氨酸含量，增加小鼠皮膚、血清、肝臟及心臟的SOD、CAT活性，并降低組織內的MDA含量，由此可見在小鼠體內金福菇多糖具有較好的抗氧化活性，可有效減緩糖代謝紊亂所產生的超氧陰離子的損害，從而在一定程度上延緩小鼠的衰老[21]，與本文研究成果一致。

本實驗利用D-半乳糖破壞細胞功能，使機體的抗氧化防御系統衰退。持續給予動物體內注射D-半乳糖，在醛糖還原酶催化下產生半乳糖醇，同時生成超氧陰離子，造成細胞膜脂質受損，造成衰老；從而制備成大鼠衰老模型，通過觀察發現，金福菇多糖對D-半乳糖衰老大鼠p16基因mRNA的表達可有效降低p16基因表達，與正常對照組相比，衰老模型組小鼠p16基因表達明顯增加（P<0.05），給予金福菇多糖治療后，p16基因相對表達明顯降低，其中中劑量組最低，但是三組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。由此可見，金福菇多糖可降低p16 mRNA的表達，很可能是其改善衰老大鼠心臟的機制，利于從分子水平去探討金福菇多糖抗衰老的機制，為中藥防治衰老提供科學依據。

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