狼毒大戟多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖及細胞因子分泌的影響

韓德軍 夏寧 鄭雙 蔣麗艷

【摘要】 目的：探討狼毒大戟多糖（EFP-AW1）對小鼠脾淋巴細胞增殖及細胞因子白介素2（IL-2）和干擾素γ（IFN-γ）分泌的影響。方法：制備小鼠脾淋巴細胞，加入EFP-AW1，使終質量濃度分別為0、25、50、100、200 mg/L，再加入Con A，培養60 h后，采用MTT法檢測不同質量濃度狼毒大戟多糖EFP-AW1對Con A誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖反應的影響；將5種不同濃度的EFP-AW1分別加入小鼠脾淋巴細胞培養體系，再加入Con A，培養48 h后，收集培養上清，ELISA法檢測不同質量濃度EFP-AW1對小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2和IFN-γ的影響。結果：與空白組比較，50、100、200 mg/L的狼毒大戟多糖能夠促進Con A誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖反應（P<0.05），并能夠提高脾淋巴細胞產生IL-2和IFN-γ的水平（P<0.05）。結論：狼毒大戟多糖具有一定的免疫增強作用。

【關鍵詞】 狼毒大戟； 多糖； 脾淋巴細胞； 白介素2； 干擾素γ

【Abstract】 Objective：To observe the effect of Euphorbia Fischeriana Polysaccharide（EFP-AW1） on proliferation and production of interleukin 2（IL-2），interferon γ（IFN-γ） of splenic lymphocytes in mice.Method：Five concentrations of EFP-AW1（0，25，50，100，200 mg/L） with Con A were added to the culture system of mouse splenic lymphocytes for 60 h，the effect of EFP-AW1 at different concentrations on splenic lymphocyte proliferation were detected by MTT method.Five concentrations of EFP-AW1（0，25，50，100，200 mg/L） with Con A were added to the culture system of mouse splenic lymphocytes for 48 h，IL-2 and IFN-γ production from splenic lymphocytes were examined by ELISA.Result：Compared with the blank group，EFP-AW1 50，100 and 200 mg/L promoted Con A induced T lymphocyte proliferation（P<0.05），and elevated IL-2 and IFN-γ production from splenic lymphocytes（P<0.05）.Conclusion：EFP-AW1 has immunity-enhancing effect.

【Key words】 Euphorbia fischeriana； Polysaccharide； Lymphocyte proliferation； Interleukin 2； Interferon γ

First-authors address： Qiqihar Medical University，Qiqihar 161000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.24.007

狼毒大戟（Euphorbia fischeriana）為大戟科狼毒屬植物，俗稱貓眼草[1]。其味辛、性平、有毒，根入藥。民間用于治療腫瘤、皮膚病、結核病等[2-3]。目前關于狼毒大戟藥理作用的文獻報道較多，尤其是其具有一定的抗腫瘤作用[4-5]。但是對于狼毒多糖成分的分離鑒定少有報道[6-7]。本課題組從中藥狼毒大戟的干燥根中發現并提取了低分子多糖化合物EFP-AW1[8]，通過前期實驗已證實其能夠抑制腫瘤細胞的轉移，而這種抑制作用是通過EFP-AW1增強荷瘤機體的免疫監視功能而發揮的[9]。為進一步研究EFP-AW1對機體免疫功能的影響，本實驗選擇小鼠脾淋巴細胞增殖實驗和細胞因子誘生實驗，旨在為EFP-AW1的進一步開發應用提供實驗依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與動物 狼毒大戟購買于齊齊哈爾市藥材公司，經齊齊哈爾醫學院郭麗娜教授鑒定為大戟科植物狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud的干燥根，EFP-AW1為本實驗室從中藥狼毒大戟中新發現并分離提取的低分子多糖化合物[8]，分子量為10.830 Da，純度>95%，用PBS配制。健康、清潔級ICR小鼠，購自吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心，雌性，體質量18～22 g，飼養環境溫度（24±1）℃，濕度（50±10）%，自由飲水采食。RPMI1640培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）：HyClone公司產品；小鼠脾淋巴細胞分離液、白細胞介素2（interleukin 2，IL-2）和干擾素γ（interferonγ，IFN-γ）ELISA檢測試劑盒：北京達科為生物技術有限公司產品；伴刀豆凝集素A（concanavalin A，Con A）：美國Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）：美國Sigma公司。酶標儀（奧地利TECAN公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾淋巴細胞懸液的制備 頸椎脫臼處死小鼠，置于75%的乙醇中浸泡消毒；在超凈工作臺中向培養皿中加入4 mL淋巴細胞分離液；從燒杯中取出小鼠捋干酒精，無菌取出小鼠脾臟；取出一張200目尼龍膜在淋巴細胞分離液中浸濕，將脾臟放在尼龍膜上用注射器活塞輕輕研磨脾臟；將懸有脾臟細胞的分離液立即轉移到15 mL無菌離心管中，沿管壁緩慢加入500 μL的RPMI1640培養基覆蓋，室溫，800 g離心30 min；吸出中間灰白色的淋巴細胞層，再加入10 mL RPMI1640培養基洗滌細胞，250 g離心10 min。傾倒上清液，重懸于含10%FCS的RPMI1640培養基中，細胞計數，備用。

1.2.2 小鼠脾淋巴細胞增殖實驗 按1.2.1方法制備的小鼠脾淋巴細胞懸液，按5×105/100 μL/孔加入96孔培養板，將細胞分為五組，空白組用完全培養基常規培養，其余各組分別加入不同質量濃度的狼毒大戟多糖100 μL，使狼毒大戟多糖終質量濃度分別為25、50、100、200 mg/L，各組再加入Con A使其終濃度為5 mg/L，每組設3個復孔。置于37 ℃、含5% CO2的培養箱中培養60 h后，各孔加入5 mg/L的MTT溶液20 μL，繼續孵育4 h，終止培養。離心，棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩溶解結晶，在570 nm波長處測定吸光度（A570 nm）值。

1.2.3 小鼠脾淋巴細胞IL-2和IFN-γ水平的測定 按1.2.1的方法制備的小鼠脾淋巴細胞懸液，按5×106 mL/孔加入24孔培養板，空白組細胞用完全培養基常規培養，其余各組分別加入不同質量濃度的狼毒大戟多糖，使狼毒大戟多糖終濃度分別為25、50、100、200 mg/L，再加入Con A使其終濃度為5 mg/L，每組設3個復孔。于37 ℃、含5% CO2的培養箱中培養48 h，離心，收集培養上清，

-20 ℃保存，用于測定IL-2、IFN-γ的含量，檢測方法參照IL-2、IFN-γ ELISA試劑盒說明書。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，進行單因素方差（ANOVA）分析和t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EFP-AW1對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響 與空白組比較，25 mg/L的EFP-AW1對Con A誘導的T淋巴細胞增殖反應無明顯影響。50、100、200 mg/L的EFP-AW1均能夠促進Con A誘導的T淋巴細胞增殖反應（t=2.404、3.207、4.528，P<0.05），見表1。

2.2 EFP-AW1對小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2的影響 與空白對照組比較，25 mg/L的EFP-AW1對小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2無明顯影響。50、100、200 mg/L的EFP-AW1均能夠促進小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2（t=2.325、5.181、4.183，P<0.05），見表1。

2.3 EFP-AW1對小鼠脾淋巴細胞分泌IFN-γ的影響 與對照組比較，25 mg/L組的EFP-AW1對小鼠脾淋巴細胞分泌IFN-γ無明顯影響。50、100、200 mg/L的EFP-AW1均能夠促進小鼠脾淋巴細胞分泌IFN-γ（t=2.704、4.017、4.336，P<0.05），見表1。

3 討論

多糖是自然界最重要的三種生物大分子之一，廣泛存在于動物、植物以及微生物的組織中，具有抗腫瘤、抗病毒、抗輻射等多種重要的生理功能，尤其對機體免疫功能，發揮著重要的調節作用[10-11]。多糖是中藥的一類重要成分，研究證明，中藥多糖在提高免疫力方面有著較強的活性[12-13]，對機體先天性免疫和獲得性免疫均具有調節作用，已成為目前中藥多糖藥理研究的熱點。脾臟是機體重要的免疫器官之一，是機體進行體液免疫和細胞免疫的重要場所[14]。本研究以脾細胞為研究對象，觀察狼毒大戟多糖對小鼠脾淋巴細胞的作用，探討其對機體免疫功能的影響。

淋巴細胞是機體進行免疫應答的重要細胞，在有絲分裂原的刺激下可以發生增殖。活化的T、B淋巴細胞是機體發揮免疫功能的重要因素，T淋巴細胞參與機體的細胞免疫應答，B淋巴細胞能分泌多種抗體，參與機體的體液免疫應答[15]。Con A是T淋巴細胞的有絲分裂原，LPS是B淋巴細胞的有絲分裂原。淋巴細胞增殖能力的強弱影響機體的免疫狀態。Con A誘導的T淋巴細胞的增殖能力常用于檢測細胞免疫水平[16-17]。本實驗小鼠脾淋巴細胞增殖的MTT結果顯示，50、100、200 mg/L的EFP-AW1均能夠顯著促進小鼠脾淋巴細胞增殖，與空白組比較，差異均有統計學意義（P<0.05），其作用呈現一定的量效關系，表明EFP-AW1能夠增強細胞免疫，從而提高機體免疫功能。

細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞活化后合成的具有調節細胞功能的低分子可溶性蛋白質[18-19]。檢測細胞因子對闡明機體免疫應答具有重要意義。Th細胞前體在抗原刺激下，分化為中間階段的Th0，Th0在不同細胞因子作用下，選擇性地向Th1或Th2細胞分化。Th1細胞偏向于分泌IL-2、IFN-γ、TNF等細胞因子，可促進細胞介導的免疫應答，Th2細胞偏向于分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細胞因子，與體液免疫應答相關[20-21]。實驗中筆者選擇了IL-2和IFN-γ進行檢測。結果顯示，50、100、200 mg/L的EFP-AW1均可顯著提高細胞因子IL-2和IFN-γ的分泌，與空白組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。由此說明合適劑量的EFP-AW1能夠促進機體的Th1型細胞免疫應答。

綜上所述，狼毒大戟多糖EFP-AW1對機體細胞免疫功能具有促進作用，對體液免疫功能的影響還有待于進一步研究。

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