青蒿素對腎癌細胞株786—0細胞的增殖和Fascin表達的影響

張靜 查文清 陳小鴻 蔣莉 蔣一雄

【摘要】 目的：探討青蒿素對腎癌細胞株786-0細胞的增殖和Fascin表達的影響。方法：選用786-0腎癌細胞株，分別通過不同濃度的青蒿素作用細胞株，收集不同時間點（0、24、48、72 h）的細胞，運用細胞增殖CCK-8法測定青蒿素對腎癌細胞株786-0細胞的增殖；通過Western Blot檢測青蒿素干預后腎癌細胞株786-0細胞Fascin的表達。結果：隨著藥物濃度的增加，青蒿素可明顯抑制腎癌細胞株786-0細胞的增殖（P<0.01），青蒿素可顯著降低腎癌細胞株786-0 Fascin蛋白的表達（P<0.05）。

結論：青蒿素通過抑制腎癌細胞增殖和Fascin蛋白的表達，從而抑制腫瘤細胞的惡性增生。

【關鍵詞】 腎癌； 青蒿素； 腎癌細胞株786-0； 增殖； Fascin

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Artemisinin on the proliferation and Fascin expression of human renal cell carcinoma cell line 786-0.Method：786-0 cell line were cultured in vitro and treated with different doses Artemisinin.The cells were collected at different time points（0，24，48，72 h）.CCK-8 method was used to detect the cell proliferation，the expression of Fascin in renal cell carcinoma cell line 786-0 cells were analyzed by Western Blot.Result：Different doses artemisinin could significantly inhibit the proliferation of renal cell carcinoma cell line 786-0 with the increase of drug concentration （P<0.01），Artemisinin could obviously reduced the expression of Fascin in renal cell carcinoma cell line 786-0（P<0.05）.Conclusion：Artemisinin might inhibit the proliferation and the expression of Fascin，then inhibit the malignant proliferation of tumor cells.

【Key words】 Renal cell carcinoma； Artemisinin； Human renal cell carcinoma cell line 786-0； Proliferation； Fascin

First-authors address：Nanshan District Peoples Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.24.008

腎癌又稱腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是指起源于腎皮質的具有異質性的腫瘤[1]。腎癌是泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，同時，腎癌起病隱匿，多發現較晚。目前，膀胱癌各種預防和治療的藥物均不理想或毒副作用較大。研究發現Fascin蛋白在多種惡性腫瘤組織中表達顯著上調，其異常表達被認為與腫瘤的發生、進展、侵襲及預后等生物學行為相關[2]。青蒿素是一類傳統的抗瘧藥，隨著臨床試驗的深入研究，其抗腫瘤作用備受關注，而在腎癌方面的研究國內外卻報道甚少[3]。本實驗以人腎癌細胞株786-0作為研究對象，應用CCK-8法和Western Blot等技術觀察青蒿素對腎癌細胞株786-0的增殖和Fascin蛋白的表達的影響?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑 材料：腎癌細胞株786-0（購買于上海中科院細胞庫）。儀器和試劑：多功能讀板機（Beckman PRADIGM）、蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）、電子天平（Satorius公司）、小型離心機（Eppendorf公司）、倒置相差顯微鏡（日本索尼公司）、Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）（上海碧云天生物技術有限公司）、Facsin Monocional Antibody（美國Millipor公司）、羊抗鼠二抗（Santa Cruz公司）、RPMI1640培養基（Gibco公司）、胰蛋白酶（Hyclon公司）、青蒿素、胎牛血清（Hyclon公司）、磷酸緩沖液（PBS）、96孔細胞培養板、6孔細胞培養板、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、二甲亞砜（DMSO）[4]。

1.2 細胞培養 將腎癌細胞株786-0細胞于含10%胎牛血清RPMI 1640培養基，5% CO2和37 ℃培養箱中培養。當細胞培養至密度為60%～80%時傳代，收集細胞進行后續實驗[5]。

1.3 藥物處理 將青蒿素溶于DMSO，再用細胞完全工作液配制成200、100、50、25 mg/L四個不同濃度的工作液。

1.4 CCK8法測定細胞增殖 在96孔板中取24個孔（取板中間孔，周圍一圈棄置，加培養基防蒸發），做好相應標記，取4個孔加培養基作為空白組，其余20孔中均加入100μL的細胞懸液（細胞計數2×103個/孔）。將培養板在37 ℃，5% CO2培養箱培養24 h，將孔中培養基吸出，向每孔加入100 μL待測藥物，各濃度均設4個附孔。培養板繼續置于培養箱孵育24 h，向每孔加入10 μL CCK-8溶液。將培養板在培養箱內孵育1～4 h，用酶標儀在450 nm處測定其吸光度。記錄結果，以青蒿素濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。腎癌細胞株786-0細胞抑制率（%）=（對照組吸光度-青蒿素藥物組吸光度值）/對照組吸光度×100%[6-8]。

1.5 Western Blot檢測Fascin的表達 RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，半干轉印到PVDF膜，5%的脫脂奶粉中封閉90 min，加一抗（Fascin 1.25∶1 000，β-actin 1∶1 000）4 ℃過夜；洗膜后加入1∶1 000的二抗稀釋液室溫下孵育1 h。ECL顯色曝光，凝膠成像系統進行掃描分析；實驗重復3次[9]。

1.6 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8法檢測青蒿素對腎癌細胞株786-0細胞的增殖 不同濃度（0、25、50、100、200 mg/L）的青蒿素對腎癌細胞株786-0細胞作用48 h后，在450 nm處其吸光度分別為（2.17±0.04）、（1.62±0.13）、（1.21±0.09）、（0.83±0.14）、（0.61±0.12）。依據抑制率（%）=（對照組吸光度-藥物組吸光度值）/對照組吸光度×100%。不同濃度（0、25、50、100、200 mg/L）的青蒿素對腎癌細胞株786-0細胞作用48 h后，其抑制率分別為0、（27.0±2.2）、（48.0±3.6）、（64.0±4.8）、（73.0±2.1）%，見圖1，各濃度間進行兩兩比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.2 Western Blot檢測不同濃度青蒿素對腎癌細胞株786-0 Fascin蛋白的表達 以GAPDH作為蛋白定量內參，運用Image J分析Fascin蛋白表達的灰度值，不同濃度的青蒿素（0、25、50、100、200 mg/L）分別干預腎癌細胞株786-0細胞作用48 h后，Fascin蛋白的灰度值分別為（158.0±10.2）、（120.0±7.5）、（82.0±11.4）、（41.0±4.8）、（33.0±6.2），與0 mg/L青蒿素比較，青蒿素藥物組干預腎癌細胞株786-0細胞后的Fascin蛋白表達均降低，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖2。

3 討論

腎癌患者往往對放療和化療耐受，其治療效果不理想，青蒿素及其衍生物是一類高效、速效、低毒的抗瘧藥物，近年來的研究發現，青蒿素及其衍生物除了具有抗瘧作用外，對多種腫瘤細胞具有選擇性抑制和/或殺傷作用[10-11]。本研究選擇腎癌細胞株786-0為研究對象，體外觀察青蒿素對腎癌細胞株786-0的增殖和Fascin蛋白表達的影響。

腫瘤的發生、發展與細胞的增殖和分化有關，腫瘤藥物可以通過多種方式抑制腫瘤細胞的生長，如調控周期、凋亡和壞死等。研究表明，青蒿素對腫瘤的殺傷主要是通過調控細胞周期和誘導細胞凋亡途徑實現[12-14]。筆者通過CCK-8實驗發現，不同濃度（0、25、50、100、200 mg/L）的青蒿素對腎癌細胞株786-0細胞作用48 h后，明顯能夠抑制腎癌細胞株786-0的生長，并隨著濃度的增加，其抑制作用呈逐漸增強趨勢，即說明青蒿素對腎癌細胞株786-0體外抑制作用明顯，可以明顯抑制腎癌細胞株786-0的增殖，從而達到腫瘤抑制的目的。研究報道腫瘤的發生是細胞過度增殖的結果，無論體外或體內的實驗都已證明，青蒿素對腫瘤有明顯的抑制作用[15]。國外有學者研究發現對青蒿素對人慢性粒細胞白血病紅白血病變細胞株的生長抑制作用，從而進一步證實了青蒿素通過抑制腫瘤細胞過度增殖作用途徑實現抗腫瘤的作用[16-17]。

Fascin是一種分子量為55 kD的骨架蛋白，主要是和肌動蛋白結合，早期研究發現Fascin蛋白在一些惡性腫瘤中表達上調，并與腫瘤的侵襲和轉移高度相關，駱曼等[18]報道Fascin蛋白在腎細胞癌中表達上調并和腫瘤的進展相關，并證實Fascin可以作為腎癌一個分子標志物，用于惡性腫瘤的診斷和鑒別，同時胡娜等[19]發現，沉默腎癌細胞中的Fascin表達后，細胞的遷移侵襲能力明顯減弱。而本研究發現，Fascin蛋白也在腎癌細胞株786-0中高表達，應用不同濃度（0、25、50、100、200 mg/L）的青蒿素對腎癌細胞株786-0細胞作用48 h后，青蒿素能夠明顯抑制Fascin蛋白在腎癌細胞株786-0的表達，即說明青蒿素可以通過抑制Fascin蛋白在腎癌細胞中的表達，從而抑制腎癌的發生發展[20]。

綜上所述，蒿素作為一種毒副作用較少的中藥成分，一定程度上能抑制膀胱癌RT4細胞的增殖，并促進其死亡，有可能成為一種新型輔助化療藥物。青蒿素在體外能夠明顯抑制腎癌細胞株786-0的增殖和Fascin蛋白的表達，至于青蒿素的確切作用機制和在體內抗腎癌作用尚需進一步探討。

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