高效液相色譜法測(cè)定加米霉素原藥含量的研究

段鵬 鄧菲 路美玉

摘要：為建立測(cè)定加米霉素含量的高效液相色譜法，試驗(yàn)應(yīng)用資生堂CAPCELL PAK C侶MG II（250×4.6mm，5μm）色譜柱，色譜乙腈溶解樣品，色譜條件以磷酸鹽緩沖液（取O.01mol/L磷酸氫二鉀溶液，用20%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0）一乙腈（ 20：80）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm;流速為1.OmL/min：柱溫為40℃。結(jié)果：加米霉素的線性范圍為1.714μg/mL-450μg/mL，四批樣品中加米霉素的含量分別是99.14%、99.20%、99.33%、99.41%。結(jié)論：該檢測(cè)方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、靈敏度高、分離效果好，適用于加米霉素原料的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：加米霉素;大環(huán)內(nèi)酯類;高效液相色譜法;含量測(cè)定;方法學(xué)考察

加米霉素是新一代半合成大環(huán)內(nèi)酯類一十五元氮雜內(nèi)酯類抗菌藥物。其分子式為C₄₀HC₇₆NC₂0C₁₂，分子質(zhì)量為777.04。化學(xué)名為13-[（2，6-二脫氧-3-C-甲基-3-0-甲基-a—L一吡喃核糖基）氧]-2-乙基一3，4，10-三脫氧3，5，8，1 0.12，14-六甲基一7一丙基-11-[[3，4，6-三脫氧-3 -（二甲氨基）-β -D-吡喃木糖基]氧]-，（ 2R，3S，4R，5S，8R，10R，11R，12S，13S，14R）-1-氧雜一7一氮雜環(huán)-15-單環(huán)。為白色至米黃色粉末，不溶于水，具有吸濕性，在高溫條件下穩(wěn)定，對(duì)光不敏感，重結(jié)晶后只有1種構(gòu)型^[1]。加米霉素在7a位上由單一丙基取代，該特殊結(jié)構(gòu)有利于其在生理pH值條件下被快速吸收，且在靶組織肺中可維持較長(zhǎng)作用時(shí)間^[2]。其動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)優(yōu)良，吸收快，達(dá)峰時(shí)間短，生物利用度較高，可以在肺組織達(dá)到較高的組織濃度，毒性低，在動(dòng)物的可食性組織中殘留較少，治療無(wú)副作用，因此受到世界各國(guó)的廣泛關(guān)注，國(guó)內(nèi)不少單位也投入了大量人力、物力進(jìn)行研究^[3-6]。目前加米霉素未收載于《中國(guó)獸藥典》及公開(kāi)發(fā)行的獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，也未收載于美國(guó)藥典、歐州藥典、英國(guó)藥典及其它各藥典，從而給研究工作帶來(lái)一定難度。本研究采用高效液相色譜法，選擇適當(dāng)分離條件（如色譜柱、流動(dòng)相、流速等）對(duì)加米霉素原料藥含量進(jìn)行測(cè)定，得到了滿意結(jié)果，可作為加米霉素常規(guī)檢測(cè)與質(zhì)量控制的方法。

1材料

1.1儀器

高效液相色譜儀（島津LC-10AD，配備LC-10AD泵、SIL-10AD自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-10Avp檢測(cè)器）;電子天平（梅特勒AL204，梅特勒一托利多儀器有限公司）;pH計(jì)（上海精科pHS-3C）

1.2樣品

加米霉素對(duì)照品（自制，純度為gg.l%.批號(hào)為20140704）、加米霉素原料藥（自制）、乙腈（色譜純，RCI Labscan Limited生產(chǎn)）、磷酸氫二鉀（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)）、磷酸（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)）。

2方法

2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取加米霉素適量，用乙腈稀釋至適宜濃度，于190 - 400nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行紫外掃描，見(jiàn)圖1。

根據(jù)圖1可知，加米霉素紫外最大吸收波長(zhǎng)在190nm左右，但考慮到該檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)試劑的高要求及試驗(yàn)操作難度，因此不選用190nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)參照中國(guó)藥典中阿奇霉素含量的檢測(cè)方法⁷，確定加米霉素含量的檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。

2.2流動(dòng)相和流速的確定

2.2.1流動(dòng)相

根據(jù)表1試驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)考慮到色譜柱對(duì)pH的耐受性，我們最終確定條件九為最終條件。

2.2.2流速

將流速調(diào)整為0.8mL/min和1.2mL/min其他色譜條件不變，精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

改變流速為0.8mL/min和1.2mL/min后，本品含量無(wú)明顯變化。最終確定流速為1.OmL/min.

2.3色譜柱和柱溫的選擇

分別采用不同廠家的C18柱對(duì)同一樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示不同廠家的C18柱檢測(cè)，加米霉素含量無(wú)明顯變化。分別將柱溫設(shè)定為35℃，40℃，45℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，不同柱溫條件下，加米霉素含量無(wú)明顯變化。

2.4溶液的配制

磷酸鹽緩沖液的配制：取0.01 mol/L磷酸氫二鉀溶液，用20%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，即得。

對(duì)照品溶液的配制：取加米霉素對(duì)照品適量，精密稱定，加乙腈制成每1mL約含0.3mg加米霉素的溶液，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液的配制：取本品適量（約含加米霉素30mg），精密稱定，置100mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1線性與范圍

將對(duì)照品貯備液用乙腈稀釋成一系列濃度，精密量取各濃度溶液20μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，表3，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作線性圖，見(jiàn)圖2。

結(jié)果：加米霉素在濃度為1.714 - 450.Oμg/mL范圍內(nèi)濃度與峰面積的線性方程為：y=2147.9x-1898.2， R2=0.9997.即在1.714 - 450μg/mL范圍內(nèi)，加米霉素峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2重復(fù)性

加米霉素重復(fù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)平均含量為100.1g%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.24%，結(jié)果表明重復(fù)性好。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

2.5.3溶液穩(wěn)定性

將對(duì)照品溶液和供試品溶液，在室溫下放置Oh，2h，4h，6h，8h，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見(jiàn)表5。

經(jīng)試驗(yàn)可知，對(duì)照品溶液和供試品溶液在室溫放置8h后，其峰面積以及含量的RSD%均小于2.0，說(shuō)明該溶液在室溫下8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4回收率

將對(duì)照品貯備液稀釋至0.24mg/mL，0.3mg/mL，0.36mg/mL，每個(gè)濃度分別制備3份溶液進(jìn)行測(cè)試，每份溶液各進(jìn)兩針。分別精密量取上述各溶液20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，見(jiàn)表6。

結(jié)果：經(jīng)試驗(yàn)，各濃度的回收率均在98% - 102%之間，平均回收率為100.05%，RSD為0.8%。試驗(yàn)結(jié)果表明，此方法準(zhǔn)確度高。

2.5.5耐用性

更換三根色譜柱，其他色譜條件不變，精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算本品含量。結(jié)果見(jiàn)表7。

試驗(yàn)結(jié)果表明，更換不同品牌的色譜柱后，本品含量無(wú)明顯變化，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)條件耐用性良好。

3結(jié)果與分析

3.1最佳色譜條件

色譜柱為資生堂CAPCELLPAKC18 MG ll（ 250×4.6mm，5μm）; 流動(dòng)相為O.01mol/L磷酸氫二鉀（ pH8.0）：乙腈=20：80;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;進(jìn)樣量為20μL;柱溫為40℃。

3.2樣品測(cè)定

3.2.1操作方法

照《獸藥檢驗(yàn)操作規(guī)程》高液相色譜法（HYZY020-2011）測(cè)定，在系統(tǒng)適用性符合要求的情況下，精密量取對(duì)照品溶液20μL，注入液相色譜議，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使對(duì)照品溶液主峰全量程顯示。再精密量取供試品溶液20μL，注入液相色譜議，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

3.2.2計(jì)算公式

f_s=C_{對(duì)照品}/A_{對(duì)照品}

F=（f₁ +f₂）/2

式中：f_s一校正因子;F一平均校正因子;C_{對(duì)照品}一對(duì)照品溶液的濃度;A_{對(duì)照品}-對(duì)照品溶液色譜峰的面積。

含量=（A_供試品*F）/C_供試品*100%

式中：F一平均校正因子;A_供試品-供試品溶液色譜峰的面積;C_供試品 -供試品溶液的濃度

3-23含量測(cè)定

分別取4個(gè)批次的加米霉素原料藥，按上述方法測(cè)定，每個(gè)批次測(cè)定3個(gè)平行樣品，結(jié)果見(jiàn)表8。

由表8、圖3和圖4可知，在探究出的最佳色譜條件下，加米霉素樣品能得到很好的分離，保留時(shí)間與對(duì)照品基本一致，峰型良好，且無(wú)明顯干擾峰。

4結(jié)論

本研究采用高效液相色譜法測(cè)定加米霉素含量，并對(duì)線性、重復(fù)性、精密度、溶液穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度進(jìn)行了詳細(xì)的研究，空白溶劑不干擾樣品的含量測(cè)定，理論塔板數(shù)≥5000，在1.714～450μg/mL范圍內(nèi)，加米霉素峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，該方法的重復(fù)性與精密度良好，回收率在98.0%～102.0%之間，溶液8h內(nèi)穩(wěn)定。檢測(cè)精度高，雜質(zhì)干擾小，而且色譜系統(tǒng)簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、快速，試劑易得，費(fèi)用低，適合于加米霉素的常規(guī)檢測(cè)。

參考又獻(xiàn)：

[1] EMA，2008.The European Agency forthe Evaluation of Medicinal ProductsZactran： EPAR - Scientific Discussionhttp：//www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-Scientific_Discu ssion/veterina ry/0001 29/WC500068716.pdf

[2]于麗佳加米霉素的合成與工藝路線研究[D]北京中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012

[3] Forbes A B，RamageC，Salesj，etal.Determination of the durationof antibacterial efficacy followingadministration of gamithromycin usinga bovine mannheimiahaemolyticachallenge modeI[J].Antimicrob AgentsChem，2011，55（2）：831-835

[4] LechtenbergK，Tessman RK，RomanoD.Efficacy of gamithromycininjectable solution for control ofpneumonia in cattle challenged withhistophilussomni after treatment[J].lnt JApp Res Vet Med，2011，9（3）：214-248

[5]王忠，王小鶯，鮑光明，等加米霉素的研究進(jìn)展[J]中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，35（10）：1708-1712

[6]張倩，中試加米霉素注射液體外抑菌試驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全性評(píng)價(jià)[D]石河子大學(xué)，2017國(guó)

[7]家藥典委員會(huì)編中華人民共和國(guó)藥典：二部[s]北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：558-559