組蛋白去乙酰化酶抑制劑NaBut抑制多發性骨髓瘤細胞增殖促進凋亡的機制研究

賈永清

[摘要] 目的 分析組蛋白去乙酰化酶抑制劑NaBut抑制多發性骨髓瘤細胞增殖促進凋亡的機制。 方法 利用0.1、0.2、0.5、1.0及2.0 μmol/L丁酸鈉（NaBut）對U266細胞株48 h進行處理，使用0.5 μmol/L丁酸鈉對細胞8、16、24、36、48 h進行處理，使用1 μmol/L M344、0.5 μmol/L LBH589、6 μmol/L NaBut、6 μmol/L VPA對細胞48 h進行處理，另在對照組中加入同等劑量的溶劑，使用MTT法對細胞存活率進行檢測，對其檢測結果進行比較。 結果 ①與對照組比較，不同濃度丁酸鈉處理細胞48 h后細胞存活率逐漸降低，差異顯著（P<0.05）；丁酸鈉濃度越高，細胞存活率則越低。②與對照組比較，0.5 μmol/L丁酸鈉處理細胞16、24、36、48 h后細胞存活率逐漸下降，差異顯著（P<0.05）；處理花費時間越長，細胞的存活率則越低。③與對照組比較，1 μmol/L M344、0.5 μmol/L LBH589、6 mmol/L NaBut及6 mmol/L VPA處理48 h后細胞存活率逐漸下降，差異顯著（P<0.05）。 結論 組蛋白去乙酰化酶抑制劑NaBut有效的抑制了多發性骨髓瘤細胞增殖促進凋亡，在抗癌方面有著良好的應用前景。

[關鍵詞] 組蛋白去乙酰化酶抑制劑；多發性骨髓瘤細胞增殖；凋亡；機制

[中圖分類號] R739.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）24-0029-03

Study on the mechanism of histone deacetylase inhibitor NaBut in inhibiting proliferation and promoting apoptosis of multiple myeloma cells

JIA Yongqing

Department of Hematology， Guangzhou First People's Hospital，Guangzhou 510425， China

[Abstract] Objective To analyze the mechanism of histone deacetylase inhibitor NaBut in inhibiting proliferation and promoting apoptosis of multiple myeloma cells. Methods The U266 cell line was treated with 0.1， 0.2， 0.5， 1.0 and 2.0 μmol/L sodium butyrate （NaBut） at 48 h. The cells were treated with 0.5 μmol/L sodium butyrate at 8， 16， 24， 36 and 48 h. The cells were treated with 1 μmol/L M344， 0.5 μmol/L LBH589， 6 μmol/L NaBut， and 6μmol/L VPA at 48 hours. The same dose of solvent was added to the control group. The cell viability was tested by MTT assay. Test results were compared. Results ①Compared with that of the control group， the cell survival rate of cells decreased gradually after treated with different concentrations of sodium butyrate for 48 h， with significant difference（P<0.05）. The higher the concentration of sodium butyrate， the lower the cell survival rate. ②Compared with that of the control group， the survival rate of the cells was gradually decreased after treatment with 0.5 μmol/L sodium butyrate for 16， 24， 36， and 48，with significant difference（P<0.05）. The longer the treatment， the lower the survival rate of the cells. ③Compared with that of the control group， the cell viability was gradually decreased afer treated with 1 umol/L M344， 0.5 μmol/L LBH589， 6 mmol/L NaBut and 6 mmol/L VPA for 48 h， and the difference was significant（P<0.05）. Conclusion Histone deacetylase inhibitor NaBut effectively inhibits the proliferation of multiple myeloma cells and promotes apoptosis. It has a good application prospect in anticancer.

[Key words] Histone deacetylase inhibitor； Multiple myeloma cell proliferation； Apoptosis； Mechanism

組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACL）屬于化合物，具有干擾與組蛋白去乙酰化酶的功能，組蛋白去乙酰化酶抑制劑分為DNA+-依賴性酶及Zn2+依賴性酶兩個類型，Zn2+依賴性蛋白酶有HDACsl、Ⅱ、Ⅳ亞組，DNA+-依賴性酶則以HDACsⅢ為主。組蛋白去乙酰化酶抑制劑通過增加細胞內組蛋白的乙酰化過程，提高了p21等基因的表達水平等途徑，抑制腫瘤細胞的增殖，誘導細胞分化及凋亡。在治療實體腫瘤方面取得了理想的效果，但是組蛋白去乙酰化酶抑制劑的抗癌作用呈現出細胞特異性或組織特異性，因此組蛋白去乙酰化酶抑制劑的抗癌機制還有待研究[1-7]。在此次研究中針對組蛋白去乙酰化酶抑制劑NaBut抑制多發性骨髓瘤細胞增殖促進凋亡的機制進行分析討論，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究材料

多發性骨髓瘤細胞株U266的培養基（上海細胞庫）為10%胎牛血清的高糖DMEM（美國Invitrogen公司）。

1.2 方法

1.2.1 利用MTT繼發對不同濃度NaBut對U266細胞增殖的影響進行分析 將胰酶消化U266細胞與96孔板進行連接，在細胞生長至融合度為50%的時候分別加入濃度為0.1、0.2、0.5、1.0及2.0 μmol/L TSA，在對照組中加入同等劑量的二甲基亞砜，在每個組別中設6個平行孔，在處理48 h后加入20 μL MTT溶液進行培養，時間為4 h，然后放棄培養液，在每個孔中加入DMSO 150 μL，進行震蕩，時間為10 min，在酶聯免疫檢測儀上對各孔490 nm波長的吸光度值進行測定，各實驗組A值與對照組A值的比值作為本組的細胞存活率。

1.2.2 利用MTT法對0.5 umol/L NaBut作用不同時間對U266細胞增殖的影響 使用0.5 μmol/L NaBut處理U26細胞8、16、24、36、48 h后，在對照組中加入同等劑量的溶劑，使用MTT法對細胞的存活率進行檢測，檢測方法同上。

1.2.3 利用MTT法對多種組蛋白去乙酰化酶抑制劑對U266細胞增殖的影響進行分析 采取多種組蛋白去乙酰化酶抑制劑（1 μmol/L M344、0.5 μmol/L LBH589、6 mmol/L NaBut、6 mmol/L VPA）處理細胞48 h，在對照組中加入同等劑量的溶液，利用MTT法對細胞增值率進行檢測，檢測方法同上。

1.3 統計學方法

本次研究數據經過SPSS19.0進行總匯處理，計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度NaBut對U266細胞增殖的影響

與對照組比較，0.1、0.2、0.5、1.0及2.0 μmol/L NaBut處理細胞48 h后細胞存活率逐漸降低，差異顯著（P<0.05）；對照組與任意一組比較NaBut濃度越高，細胞存活率則越低，差異顯著（P<0.05）。見表1。

2.2 0.5 μmol/L NaBut在不同時間對U266細胞增殖的影響

在于對照組比較后發現，0.5 μmol/L NaBut處理細胞16、24、36、48 h后細胞存活率逐漸下降，差異顯著（P<0.05）；處理花費時間越長，細胞的存活率則越低，差異顯著（P<0.05）。見表2。

2.3 不同組蛋白去乙酰化酶抑制劑對U266細胞存活率的影響

在與對照組進行比較后發現，1 μmol/L M344、0.5 μmol/L LBH589、6 mmol/L NaBut及6 mmol/L VPA處理48 h后細胞存活率逐漸下降，差異顯著（P<0.05）。見表3。

3 討論

多發性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是一種血液系統惡性腫瘤，其發病率占所有腫瘤的1%，占所有惡性血液病患者的10%以上。大量研究數據提示，組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑活性提高可促進腫瘤細胞增殖、細胞周期阻滯和凋亡。因此，HDAC抑制劑已經成為新一代腫瘤治療的靶標，目前已有相關成熟研究的抑制劑包括vorinostat、rocilinostat和panabinostat。丁酸鈉（NaBut）屬于HDAC抑制劑，HDAC抑制劑對MM有一定的抑制作用，但是其參與抑制MM活動的作用機制尚未得到充分闡明[8-15]。近年來研究顯示，表觀遺傳調控與多發性骨髓瘤的發生發展存在密切相關，組蛋白脫乙酰酶抑制劑NaBut在各種生理過程中均發揮重要作用，包括炎癥和分化，而其在多發性骨髓瘤的治療中的功能及機制尚未被探索。大量研究數據提示，HDAC活性提高可促進腫瘤細胞增殖、細胞周期阻滯和凋亡[16-20]。

經臨床大量研究發現，組蛋白去乙酰化酶抑制劑的抗癌效果較為理想，對多種實體瘤均具有抑制作用，根據HDACs催化結構域的特點設計了一些可以抑制其活性的小分子化合物，主要有脂肪酸類、氧肟酸鹽、環肽類及環氧肟類，其中SAHA及FK-228已經被應用在治療皮膚性淋巴癌疾病中，其他一些組蛋白去乙酰化酶抑制劑也在臨床試驗中，丙戊酸鈉是臨床常用的抗癲癇藥物，抑制了HDAC的活性且可以穿透血腦屏障，目前臨床正在將其應用在膠質瘤疾病中，由此可見組蛋白去乙酰化酶抑制劑是一種很有前景的抗癌藥物。在本研究中，與對照組比較，不同濃度丁酸鈉處理細胞48 h后細胞存活率逐漸降低，與對照組比較，0.5 μmol/L丁酸鈉處理細胞16、24、36、48 h后細胞存活率逐漸下降，細胞存活率與丁酸鈉濃度、處理花費時間具有相關性。丁酸鈉濃度越高，細胞存活率則越低。處理花費時間越長，細胞的存活率則越低。說明NaBut以劑量和時間依賴性的方式降低了人MM細胞株的存活率，誘導其細胞凋亡，抑制MM細胞增殖。與對照組比較，1 μmol/L M344、0.5 μmol/L LBH589、6 mmol/L NaBut及6 mmol/L VPA處理48 h后細胞存活率逐漸下降，差異顯著（P<0.05）。因此，本研究結果提示NaBut是一種潛在的MM治療藥物，并有可能改善既往MM藥物治療產生耐藥性的情況。

總之，組蛋白去乙酰化酶抑制劑NaBut有效的抑制了多發性骨髓瘤細胞增殖促進凋亡，這些發現為臨床治療多發性骨髓瘤提供了新的治療策略，也為NaBut在臨床的運用提供理論及實踐依據。

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（收稿日期：2018-03-28）