荔波唇柱苣苔種子誘導組織培養和快速繁殖

玉屏 王萬海 熊志斌 王蓮輝

(1.貴州茂蘭國家級自然保護區管理局，貴州荔波558400；2.貴州省林業科學研究院，貴州貴陽550005)

引言

荔波唇柱苣苔 (Chirita liboensis)為苦苣苔科(Gesneriaceae)唇柱苣苔屬 (Chirita)多年生草本植物，僅產于貴州荔波，為荔波特有種。荔波唇柱苣苔生于石灰巖地區低山林下陰濕處石上，是適應于石灰巖堿性生長環境的喜鈣植物，具有明顯的石生性和喜鈣性，對生長有較為嚴格的專一性，且種群植株數量一般較少。荔波唇柱苣苔還具有較好的觀賞性，其花色藍中帶紫，紫中有藍，花朵較多，葉片大，葉脈銀色，適宜于室內盆栽觀賞。

該物種因長在深山無人識，未能得到較好的開發利用，為達到商品化生產和保護野生資源的作用，本文以荔波唇柱苣苔的果實為外植體，進行無菌播種開展組培試驗，篩選最適合播種誘導、增殖分化、生根培養基，研究荔波唇柱苣苔快速繁殖技術，為荔波唇柱苣苔規模化培育開發利用提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選用茂蘭喀斯特地區生長的野生荔波唇柱苣苔果實作為組培外植體，所選的果實長勢優良，無病蟲害。種子采摘后立即帶回實驗室進行組織培養等研究。

1.2 試驗方法

將采集的荔波唇柱苣苔果實，用洗衣粉溶液洗去外表污染物，然后用流動自來水反復沖洗干凈備用。在超凈工作臺上將洗凈的果莢用75%酒精溶液滅菌30S后用無菌水沖洗3次，然后用0.1%HgCl2溶液振蕩5min，最后用無菌水反復沖洗5～6次，放在無菌紙上吸干果實表面水分。將消毒好的荔波唇柱苣苔果實用消毒剪刀將一端剪開一小口，輕輕抖動果實把里面的種子均勻播散在培養基上。

所有培養基均添加4g/L瓊脂和20g/L蔗糖，pH值調節為5.4～5.8。接種后培養條件為：溫度 (25±3)℃， 光照強度 30～40μmol·m-2·s-1， 光照時間12h/d。

1.3 誘導種子萌發

將消毒好的種子均勻播種于MS基本培養基上，進行無激素添加培養與附加不同激素濃度配比的培養基進行誘導種子萌發對比試驗。設計NAA濃度為0.1mg/L， 6-BA 濃 度 為 0.1、 0.5、 1.0、 1.5、2.0mg/L5個濃度梯度。每個處理10瓶，每瓶播種3團，每個處理重復3次。45d后，觀察種子萌發的情況，統計萌發率。萌發率＝萌發團數/接種團數×100%

1.4 原球莖增殖分化的培養

將萌發出的原球莖和小芽接種于添加不同濃度6-BA的MS基本培養基上進行培養。設計NAA濃度為0.1mg/L， 6-BA 濃度為 0.1、 0.3、 0.5、 0.8、 1.0、1.2、1.3、1.5mg/L8個濃度梯度。每個處理10瓶，每瓶接種3團原球莖和小芽，每個處理重復3次。30d后觀察增殖情況，統計增殖倍數。

1.5 壯苗生根的培養

等分化出的植株生長出3～5片葉的時候，將單株小苗接種到 NAA濃度為 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L5個濃度梯度的MS培養基上。每個處理接種10瓶，每瓶接種1株小苗，每個處理重復3次。觀察小苗生根情況并計算生根率。生根率＝生根瓶數/接種瓶數×100%。

1.6 數據處理方法

用Excel 2007進行數據統計處理，用SPSS18.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析，差異顯著的采用多重比較。

2 實驗結果與分析

2.1 激素的添加對種子萌發的影響

荔波唇柱苣苔接種于表1所示的培養基上，45d后6個處理均有種子萌動形成原球莖。

根據方差分析及對不同試驗處理進行多重比較后，結果表明 (表1)不同濃度激素處理對荔波唇柱苣苔種子萌發的影響表現差異顯著。當6-BA濃度低于0.1mg/L時種子萌發率開始降低，以不添加激素萌發率為最少。當6-BA濃度大于1.0mg/L時種子萌發出現膨大，隨著激素濃度增高，膨大現象越嚴重。經過統計，其中以處理3為最佳，萌發率達98%，萌發原球莖疏松呈綠色。15d后，新芽數量逐漸增多，出現少量小芽展出2片真葉的幼芽。

2.2 不同激素濃度組合對原球莖和小芽增殖分化的影響

將初代培養形成的原球莖和小芽分別轉接到MS為基本培養基的增殖培養基上，研究不同激素配比對原球莖和小芽增殖的影響。

根據方差分析及對不同濃度激素處理進行多重比較分析，結果顯示 (表2)不同濃度激素處理對荔波唇柱苣苔增殖分化的影響表現差異不顯著。不同濃度值激素對原球莖和小芽均有增殖，增殖的數量雖然無明顯差異，但隨著6-BA濃度的升高分化出的小苗逐漸出現葉片卷曲，苗叢密集，過度微型化等現象，有部分葉片出現白化透明狀態。經過對比，當6-BA濃度為0.1mg/L時為最佳，增殖倍數高，形成植株形態快，且數量多。30d后，分化的原球莖和小芽形成植株形態，具有3～5片葉，葉片呈現綠色葉面上被白色絨毛，有少量白色須根出現。

表1 不同濃度激素處理對種子萌發率的影響

表2 不同濃度激素配比對增殖分化的影響

2.3 不同濃度NAA對荔波唇柱苣苔生根的影響

將分化生長出4～5片葉以上的植株接種于MS基本培養基上，添加不同濃度的NAA(見表3)作為生根培養基誘導無菌苗生根。從表3可知，荔波唇柱苣苔生根較容易，不同濃度的激素下均能生長出根。但隨著NAA濃度升高，植株莖干生長較快，約能長出3個節間莖段但較脆弱，不利于出瓶栽培。經觀察，當NAA濃度為0.5mg/L時生根狀況和植株狀況為最佳，在小苗底部四周逐漸長出數條白色的細根長約0.5～1.5cm，45d后白色細根顏色逐漸變深變長約3～5cm左右，葉片變大變寬，長約3cm以上，寬約2～3cm，顏色呈深綠色，葉片被白色絨毛，生長健壯。

表3 不同濃度NAA對生根的影響

2.4 荔波唇柱苣苔的煉苗與移栽

組培瓶苗的健壯度與移栽后的管理對苗的成活具有很大的影響。選擇生長健壯的荔波唇柱苣苔植株開口煉苗后，將其栽培于消毒發酵好的鋸木面中，溫室內培養30d后將小苗移到室外，放置在散射光照條件下培養，每天進行噴霧保濕。荔波唇柱苣苔組培苗經煉苗后，室外移栽成活率達85%以上。

3 結果與討論

本文以通過對荔波唇柱苣苔種子進行無菌萌發誘導、增殖分化和生根培養的方式進行研究，建立了荔波唇柱苣苔組織培養快速繁殖體系。

結果表明：在設計的培養基中，種子萌發培養基為MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA；繼代增殖分化培養基為MS+0.1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA；生根壯苗培養基為：MS+0.5mg/LNAA。以上培養基均添加4g/L瓊脂和20g/L蔗糖，pH值調節為5.4～5.8。

4 意義與進展

荔波唇柱苣苔是荔波特有種，屬于狹域性分布的類群，稀有性明顯，無論在科學研究上還是在物種保存上都有重要意義。荔波唇柱苣苔利用種子開展的組培培養和快速繁殖尚未見報道。