筍用竹正常植株和病害植株根際微生物的分析

駱棟卿

(廣西壯族自治區國有高峰林場，廣西南寧530001)

筍用竹不僅是綠色資源，還可以應用到保健藥物中，成為保健食品。在現代生活中，加工筍用竹已成為新時期中的新型行業。目前，我國筍用竹生長對地域與季節有較高的要求，如果在淡季種植筍用竹，那么好的竹筍與筍用竹便會有所減少，因此，在竹筍種植的過程中，應加強生理上的特性，加強對淡季竹子和生態環境的分析。以此為今后的研究提供有效的理論依據。

本次研究的目的是分離和鑒定具有病害和正常竹筍根際微生物，比較兩者檢驗出的結果，為竹筍的種植和病害防治提供參考資料。

1 筍用竹正常植株和病害植株根際微生物的實驗研究

采樣點選擇的地點是廣西大學林學院，為亞熱帶季風濕潤的氣候地區，此地域年平均氣溫為21.9℃，最高溫度是29℃，最低氣溫是-12.7℃，平均年降水量是1411.4mm，無霜期平均濕度在80%以上，年日照時間為1717.35h。竹園植被覆蓋率為85%，此竹園里種植多種竹子，如青竹、四季竹、慈祥竹、綠竹、佛肚竹等。

2 一般材料與方法

2.1 一般材料

試驗材料均為二年生的筍用竹。正常植株高為3.5m左右，直徑為3.1cm左右，葉子的顏色屬于深綠色。病株高為2.8m，直徑在2.5cm。大部分葉子都會出現枯萎等癥狀，并且仔細觀察可以從葉柄處看見白色的害蟲。

2.2 方法

2.2.1 采樣方法

從東、南、北、西4個方向挖掘出竹根表層土壤，在10 An深度處可以發現竹根。從竹根的末端和中部段切斷。直徑為9mm，厚度為4mm的土壤。

“?”代表普通植物， “＠”代表病株， “?”代表竹園的空地，奇數表示根的末端，偶數表示根的中間”，并對收集到的土壤進行編排。表1展示所有的情況。在實驗的過程中，應戴上無菌乳膠手套，將土壤揉成小于2mm的土樣，放入牛皮紙樣袋中，最后存放于4℃冰箱中，以便日后使用。

表1 植株采樣對比表

2.2.2 樣品處理

?1、?3、?5、?7的平均混合為1(以下4組樣品以相同的方式混合)，?2、?4、?6、?8。＠1、＠3、＠5、＠7為3號；＠2、＠4、＠6、＠8為4號；?1、?2為混合性5號。

2.2.3 微生物種群的分離

從編號為1/2345的5份樣品中取出14g樣品，分別放入裝有150mL無菌水的三角瓶中，固定棉花塞，振動30min無菌操作，1mL稀釋成為5個數量級，稀釋10、10、10、10、10?，并將Q1mL分別用在3種細菌和真菌培養上。細菌培養基和真菌培養基分別在34℃、27℃恒溫培養箱中培養滿24h后進行觀看。

2.2.4 微生物種群的純化

培養24h后，選擇不同菌落并接種到培養基中。在恒溫條件下振蕩培養6h后，細菌按照規定的程序再次進行分離培養，直到平板上的所有菌落與肉眼沒有明顯差異。然后單一菌落在培養基中培養6h，將液體在斜面上孵育24h，然后保存在冰箱中，防備日后使用。

2.2.5 微生物的分類鑒定

生理生化鑒定方法：描述第1批分離菌落 (平涂24h)的形態，包括菌落大小、形狀邊緣、突起、干燥、透明質、顏色以及菌落數量，并在諸多菌落中識別出相同或相似的菌落。

革蘭氏染色：培養6h，將細菌環固定在玻璃玻片上，用1 min的洗滌碘染成結晶紫，放置在空氣干燥的地帶，用脫色液洗凈30次，在此渲染洗干2min。以致顯微能夠觀察到顏色的形態。

孢子染色：培養24h后取菌液，并固定在玻璃玻片上，飽和孔雀石綠色染色10m再洗干，直到菌絲體呈紅色孢子呈綠色為止。

暴露酶實驗：分離培養24h的細菌液體，用3%過氧化氫涂抹在玻片玻璃上，觀察是否產生氣泡。

半固體培養基穿刺培養：將細菌液體接種于半固體試管培養基中，接種環6h，培養24h，最后觀察細菌是否產生了擴散的跡象。

明膠反應：在明膠培養基上接種30h后，培養6d以后，觀察明膠液化是否發生了變化。

耐鹽板：在不同濃度的鹽板上培養24h后，觀察細菌在室溫下的生長情況。

3 結果與分析

3.1 不同植株的根際微生物數量

根際土壤樣品在選擇性細菌培養基和真菌培養基后。培養出的基稀釋涂布盤 (細菌10倍，10倍的真菌)，以及不同植物根際微生物在培養皿中形成的菌落如圖1所示。

圖1 不同植株的根際微生物數量圖

同時，在此對不同形態的菌落進行分離純化。結果表明根部微生物數量多于根部數量，因此得出筍用竹微生物最多的部位是根部；病害植物根際微生物數量比正常植物中的微生物較多；根際微生物數量少于對照土壤；平均土壤中根際細菌的ER為1×10 CFU；竹筍根際真菌平均數量為9.4×10 CFU，統計結果見表2。

3.2 不同植株的根際微生物種群

3.2.1 細菌初步鑒定及種群的比較

通過菌落形態鑒定、形態分類、革蘭氏菌、明膠液化、接觸菌的鑒定中，可以初步鑒定正常筍用竹與病株竹筍根際微生物的類型。198株細菌中從正常植物根際土壤中可以分離出6屬，229株細菌可以從病株根際土壤中分離出8屬。其中，芽孢桿菌、變形桿菌、農桿菌屬優勢種群，Bocholderia病株是根際微生物所存有的一種菌屬。與正常植物根際細菌相比，病株根際細菌數量較多，病菌的群體也比較廣泛，有可能與正常植物的抵抗作用能力有著密切的聯系。

表2 筍用竹正常植株與病害植株的根際微生物的數量

表3 筍用竹正常植株與病害植株的根際細菌種類及數量(菌株數·株-1)

3.2.2 真菌初步鑒定及種群比較

以孟加拉紅和鏈霉素為篩選劑。根據菌落、細胞形態和孢子的特征，初步對菌類進行鑒定，結果表4所示。48種真菌可以從正常植物根際土壤中分離出4個屬。而從60種真菌可以從病株根際土壤樣品中分離出6屬，表格中明顯表示了這幾個種屬。表4中的毛霉、青霉、曲霉和酵母菌屬于相同屬，每個屬種基本都相同；正常植物根部真菌的數量比根部中間的真菌較多，病株根部和根部中部的真菌數量是相同的，其中的因素有可能是因為植物的健康與外界的干擾因素有較大的關系；Puccinia phyllostachys和普通鐮刀菌是病害植物根際土壤中特有的一種。

表4 筍用竹正常植株與病害植株的根際細菌種類及數量(菌株數·株-1)

3.2.3 致病微生物的分析

普通變形桿菌、Bockhord nion Puccinia mongolica和Fusarium vulgaris都被稱為致病菌，但普通變形桿菌Bockholderia cepacia一般病菌都會出現在小動物身上，沒有相關植物感染的報告。因此，普通變形桿菌、頭孢菌素并不是是竹筍致病菌。感染病害的筍用竹莖有黑點、葉柄粉狀、葉片呈黃色、根系統也有黑斑、EM明顯變短、整體會慢慢腐爛，最后部分死亡。因此，根據以上狀況可以判定該植物應感染了Puccinia phyllostachys和普通鐮刀菌。

4 小結與討論

從正常植物根際土壤中分離到198株細菌和48株真菌，從根際土壤中分離到229株細菌與60株真菌。其中，芽孢桿菌與農桿菌屬是常見群體，變形桿菌和Bockholdsp是病株根際微生物特有的兩種菌類。而屬毛霉、青霉、曲霉和酵母菌中的每個屬的數目基本相同。銹菌屬和鐮刀菌屬是病害植株植物根際土壤特有的物種。

與筍用竹正常植株根際微生物相比，病株根際微生物數量較多，種族比較廣，產生此原因有可能與正常植株根際微生物抵抗作用有關。根部末端的微生物數量比根部、中部的微生物數量較多。筍用竹正常植株細菌在土壤中根際細菌的平均數為1.1×10 cfu，而真菌平均數為9 4×10 cfu。

通過對平板菌落數和菌落特征的描述，發現在病竹中培養根際微生物數量比正常筍用竹植株菌數較多，可以看出根際土壤中的微生物可以在植物根周圍形成保障區。在此種微生態環境下，保護植物根系可以有效降低病菌與害蟲侵犯的次數，因此，植物根際微生物的研究是研究防治植物微生物細菌的基礎。此外，在細菌研究的結果中還發現了RHI中的主要細菌。相關研究結果表明，芽孢桿菌對水稻紋枯病和番茄青枯病有一定的影響，而芽孢桿菌對植物病原具有較強的拮抗能力與廣譜。這些微生物作為本地微生物，與植物雙方有一定的影響作用機制，了解和理解這些菌株之間所存在的關系以成為現代科學研究的一個熱點話題之一。

在此鑒定中，檢測細菌的種類通常應用形態學觀察法進行鑒別，包括革蘭氏的運動觀察等方法。對生理和生物進行了厭氧、好氧、完全培養基和基礎培養基培養、生物降解性試驗等化學實驗。對16 sddna序列進行了擴增，進行測序，并將檢測到的序列與GenEbank中的細菌序列進行比較。在正常的情況下，同源性在90%以上就可以確定細菌的屬性，但無法辨別出細菌的種類。由于本實驗提供了足夠的實驗數據，在物種鑒定方面具有較高的可靠性。