神經母細胞瘤干細胞轉錄因子的表達與意義*

李美楠，朱秀麗，曲凡，刁玉巧

（河北醫科大學第四醫院 兒科，河北 石家莊 050011）

兒童神經母細胞瘤（Neuroblastoma, NB）是兒童中常見的顱外惡性實體腫瘤，起源于胚胎神經嵴，發生于交感或副交感神經系統所在部位，以腎上腺髓質最為常見[1]。其病因未明，占全部兒童惡性腫瘤死亡率的15%，診斷時多為中晚期，目前治療效果差，預后不佳。因此，進一步研究NB的發病和進展機制，將為兒童NB的診斷和治療提供新的理論依據，有助于提高臨床療效和改善預后。目前有學者認為兒童NB的發生與腫瘤干細胞有關[2]。本研究通過檢測C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4 4種干細胞轉錄因子在兒童NB組織中的表達情況，分析其與病理類型、臨床分期、術前有無化療的關系以及4種干細胞轉錄因子表達之間的相關性，進一步探索這4種干細胞轉錄因子在NB發生、發展過程中所起的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取河北醫科大學第四醫院兒科2007年1月至2016年3月手術切除或者活檢，并經病理確診的53例神經母細胞瘤患兒（實驗組）石蠟包埋組織標本切片。其中，男性31例，女性22例；年齡1～9歲，中位年齡5歲，≤5歲的38例，＞5歲的15例。另取10例嚴重腎盂積水患兒手術后殘余的正常腎上腺組織作為對照組，所取標本經甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋。以上所有標本均經2位有經驗的病理科醫師獨立診斷，并通過手術或影像學檢查確定侵犯部位和分期。實驗組根據國際INSS分期系統[3]，分為Ⅲ期20例和Ⅳ期33例；按病理分型，分為節細胞-神經母細胞瘤組19例和神經母細胞瘤組34例；按照術前是否經放化療干預，分為術前骨髓檢查明確已有骨髓浸潤的化療組33例（化療方案按上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心制定的NB-99治療方案[4-5]）和術前骨髓檢查無骨髓浸潤的未經過任何放化療干預直接手術切除組20例。

1.2 主要試劑

C-Myc兔抗人多克隆抗體（美國Bioworld Technology公司），Klf4兔抗人多克隆抗體（美國ProSci Incorporated公司），Oct4兔抗人多克隆抗體（美國Bioworld Technology公司），Sox2兔抗人單克隆抗體、免疫組織化學染色試劑盒（北京中衫金橋生物公司），設對照PBS代替一抗作陰性對照，選擇獲得陽性切片作為陽性對照。

1.3 免疫組織化學判斷標準

以下免疫組織化學結果判定在雙盲下進行，隨機選擇5個（×20）視野，計數1 000個細胞中陽性染色細胞，細胞陽性率=（陽性表達細胞數/1 000）×100%。C-Myc、Sox2及Klf4染色陽性部位均位于神經母細胞瘤細胞核，Oct4染色陽性部位位于神經母細胞瘤細胞質。染色強度：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。陽性細胞所占的百分比：0分為陰性（無陽性細胞），1分為陽性細胞≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為＞75%。按兩者乘積數將每個標本的表達強度分為4個等級：陰性（-）Ⅰ級（0、1、2分）；弱陽性（+）Ⅱ級（3、4分）；中度陽性（++）Ⅲ級（6、8分）；強陽性（+++）IV 級（9、12分）[6]。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，結果以陽性率（%）表示，用連續校正χ2檢驗和四格表資料的Fisher確切概率法，采用Spearman等級相關分析進行相關性比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4在兒童NB的表達

C-Myc、Sox2和Oct4在兒童NB的表達呈強陽性（+++）（見圖1A～C），Klf4在兒童NB的表達呈陽性（++）（見圖1D）。

圖1 C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4在兒童NB的表達情況

2.2 C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4在正常腎上腺組織中的表達

C-Myc、Sox2、Oct4和Klf4在正常腎上腺組織中的表達呈陰性。見圖2A～D。

圖2 C-Myc、Sox2、Oct4和Klf4在正常腎上腺組織中的表達

2.3 C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4在兒童NB的表達

對照組和實驗組的C-Myc陽性率比較，經χ2檢驗差異有統計學意義（χ2=12.381，P=0.000），實驗組的陽性率高于對照組；節細胞-神經母細胞瘤組和神經母細胞瘤組的陽性率比較經Fisher精確檢驗差異有統計學意義（P＜0.05），神經母細胞瘤組陽性率高于節細胞-神經母細胞瘤組；Ⅲ期組和Ⅳ期組的陽性表達率比較經Fisher精確檢驗差異無統計學意義（P＞0.05）；術前化療組和術前無化療組的陽性表達率比較經Fisher精確檢驗差異有統計學意義（P＜0.05），術前無化療組的陽性表達率高于術前化療組；不同年齡、性別分組的陽性表達率比較經Fisher精確檢驗差異無統計學意義（P＞0.05）。對照組和實驗組的Sox2陽性率比較經χ2檢驗差異有統計學意義（χ2=4.251，P=0.039），實驗組的陽性率高于對照組；節細胞-神經母細胞瘤組和神經母細胞瘤組的陽性率比較經Fisher精確檢驗差異無統計學意義（P＞0.05）；Ⅲ期組和Ⅳ期組的陽性表達率比較經Fisher精確檢驗差異無統計學意義（P＞0.05）；術前化療組和術前無化療組的陽性表達率比較經Fisher精確檢驗差異有統計學意義（P＜0.05），術前無化療組的陽性表達率高于術前化療組；不同年齡、性別分組的陽性表達率比較經Fisher精確檢驗差異無統計學意義（P＞0.05）。對照組和實驗組Oct4的陽性率比較經χ2檢驗差異無統計學意義（χ2=4.307，P=0.038）；節細胞-神經母細胞瘤組和神經母細胞瘤組的陽性率比較經Fisher精確檢驗差異有統計學意義（P＜0.05），神經母細胞瘤組的陽性率高于節細胞-神經母細胞瘤組；Ⅲ期組和Ⅳ期組的陽性表達率比較經Fisher精確檢驗差異無統計學意義（P＞0.05）；術前化療組和術前無化療組的陽性表達率比較經Fisher精確檢驗差異有統計學意義（P＜0.05），術前無化療組的陽性表達率高于術前化療組；不同年齡、性別分組的陽性表達率比較經確切概率檢驗差異無統計學意義（P＞0.05）。對照組和實驗組的Klf4陽性率比較經χ2檢驗差異有統計學意義（χ2=8.810，P=0.030），實驗組陽性率低于對照組；節細胞-神經母細胞瘤組和神經母細胞瘤組的陽性率比較經Fisher精確檢驗差異有統計學意義（P＜0.05），神經母細胞瘤組陽性率低于節細胞-神經母細胞瘤組；Ⅲ期組和Ⅳ期組的陽性表達率比較經Fisher精確檢驗差異無統計學意義（P＞0.05）；術前化療組和術前無化療組的陽性表達率比較經Fisher精確檢驗差異有統計學意義（P＜0.05），術前無化療組術前化療組的陽性表達率低于；不同年齡、性別分組的陽性表達率比較經Fisher精確檢驗差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1～4。

表1 對照組和實驗組4種干細胞轉錄因子陽性率比較 %

表2 節細胞-神經母細胞瘤組和神經母細胞瘤組4種干細胞轉錄因子陽性率比較 %

表3 Ⅲ期組和Ⅳ期組4種干細胞轉錄因子陽性率比較 %

表4 術前化療組和術前無化療組4種干細胞轉錄因子陽性率比較 %

2.4 Spearman等級相關分析結果

C-Myc和Sox2在兒童NB組織中的表達呈正相關（rs=0.394，P=0.023）；Sox2和 Oct4表達呈正相關（rs=0.567，P=0.010）；C-Myc與Oct4的表達無相關（rs=0.351，P=0.250）；C-Myc和Klf4表達呈負相關（rs=-0.586，P=0.000）；Sox2和klf4表達呈負相關（rs=-0.585，P=0.000）；Oct4和Klf4表達呈負相關（rs=-0.630，P=0.000）。

3 討論

隨著對腫瘤研究的不斷深入，發現在腫瘤細胞中存在一小部分細胞，即TSCs細胞（tumor stem cells）與干細胞具有相似的生長調控機制，具有不斷自我更新、多向分化及高度致瘤能力。其數量雖然極少，但是在惡性腫瘤發生、進展、轉移、化療耐藥及復發中起著重要作用，是腫瘤發生、發展、轉移及復發的根源[7]。自2006年日本科學家TAKAHASHI等[8]應用Sox2、Klf4、Oct4和C-Myc形成誘導性多潛能干細胞（induced human pluripotent stem cell, iPS）以來，上述4種胚胎性干細胞轉錄因子與各種類型的干細胞的研究不斷更新，而他們是否參與并促進腫瘤的發生、發展，尚待研究。有相關文獻報道，Oct 3/4及Sox2之間可形成復合體調控下游基因表達，同時與其他基因相互作用，將LIF/Stat3，Wnt/β-catenin，JAK/STAT3，PI3K/AKT等信號通路聯系在一起，構成調控胚胎發育的信號傳導網絡，并在該網絡中發揮核心調控作用[9-14]。C-Myc蛋白是發現最早的與腫瘤細胞增殖活性相關的原癌基因產物之一，介導細胞外傳入細胞內的生物信號向細胞核內傳遞，參與細胞增殖和細胞凋亡的調控[15-18]，與多種腫瘤的發生、發展有關，如腎癌[19]、乳腺癌[20]、食管癌等[21]。大多數研究都表明Sox2的過表達與腫瘤的惡性生物學行為及預后不良密切相關。KIM等[22]研究發現，在誘導性多能干細胞的形成過程中所需的眾多基因，如Oct3/4、Sox2、Klf4、C-Myc等，只有Oct4是形成多潛能性干細胞唯一不可缺少的基因。隨著對腫瘤的深入研究，眾多學者發現Oct4在腫瘤的發生、發展過程中也發揮重要作用，并與腫瘤干細胞關系密切。YANG等[23]在神經母細胞瘤I型細胞系的研究中證實，下調Oct4的表達可以誘導腫瘤細胞的分化。以上研究成果均提示，Oct4的高表達與腫瘤的高度惡性有關，可能成為判斷預后的指標。本實驗在分析兒童NB組織中C-Myc、Sox2、Oct4和Klf4的表達情況以及彼此之間的相關性中發現，這4種因子在NB組織中的表達均為陽性，C-Myc與Sox2、Oct4與Sox2在兒童NB組織中的表達呈正相關，而C-Myc與Oct4的表達無關，提示C-Myc、Oct4與Sox2在兒童NB的發生、發展過程中相互協同發揮作用。Klf4與C-Myc、Oct4、Sox2在兒童NB組織中的表達呈負相關，提示Klf4與C-Myc、Oct4、Sox2在兒童NB的發生、發展過程中發揮作用是相互拮抗的。實驗發現C-Myc和Oct4在節細胞-神經母細胞瘤組織中的表達低于其在神經母細胞瘤組織中的表達，Klf4的表達則與之相反，提示C-Myc、Oct4、Sox2可能與兒童NB組織的分化程度相關，可能成為判斷預后的指標。因此，可設想在未來的研究中嘗試通過下調Oct4和C-Myc的表達誘導兒童NB向分化良好的類型分化，降低其惡性程度，改善預后。Klf4在人體內多種組織和細胞中廣泛表達，參與多種生理功能，如胚胎發育、細胞增殖、分化、凋亡、維持干細胞的全能性[24-25]等。Klf4在腫瘤的發生、發展及轉移過程中，作為抑癌基因或癌基因，發揮著完全不同的作用。如Klf4可以維持乳腺癌腫瘤干細胞的自我更新，促進癌細胞的侵襲和轉移，發揮癌基因作用[26]。本研究中C-Myc、Oct4及Sox2在術前未行化療組的兒童NB組織中的表達均高于其在術前化療組的表達，而Klf4在術前未行化療組兒童NB組織中的表達低于其在術前化療組的表達，提示化療藥物對C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4的表達有影響，推測 C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4可能與化療藥物發揮作用的機制相關，可反映兒童NB的化療效果，作為判斷治療療效的指標，有望成為NB治療的新靶點。C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4在NB組織中的表達與年齡、性別及臨床分期無關。本研究只是發現干細胞轉錄因子C-Myc、Sox2、Oct4及Klf4在兒童NB組織中的表達現象，還需進一步研究其與神經母細胞瘤的發生、發展相關的機制，探索更為有效的治療方法以降低兒童NB的惡性程度，提高化療療效，改善NB患兒預后。