宮頸鱗癌組織中c-fos蛋白表達(dá)與HPV感染的相關(guān)性*

張玉芳，任春麗，梁爽，張金環(huán)，郭艷巍，侯敬

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河北 承德 067020）

目前研究者認(rèn)為宮頸癌的發(fā)生與持續(xù)的人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus, HPV）感染密切相關(guān)。特別是高危型HPV（HPV16、18、31、45等）的持續(xù)性感染，是宮頸癌發(fā)病的主要原因[1-2]。原癌基因c-fos是即刻早期基因家族中的一員，其在腫瘤的侵襲、細(xì)胞外基質(zhì)的降解、異常黏附及轉(zhuǎn)移灶新生血管形成等多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用[3]。本研究通過檢測宮頸鱗癌和宮頸病變組織中c-fos蛋白表達(dá)和HPV的感染情況，探討c-fos是否與HPV感染協(xié)同參與宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展過程。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科門診及病房2012～2016年經(jīng)病理確診為宮頸鱗癌和癌前病變的標(biāo)本共148例。患者年齡25～64歲，平均48.2歲，其中，＜45歲患者68例，≥45歲患者80例。依據(jù)病理學(xué)診斷結(jié)果為慢性宮頸炎癥組（31例）、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL）組（35例）、高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL）組（33例）及宮頸鱗狀細(xì)胞癌組（49例）。宮頸鱗癌組中，＜45歲患者18例，≥45歲患者31例。按腫瘤分化程度：高分化16例，中低分化33例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例。

1.2 方法

1.2.1 宮頸鱗癌組織HPV-DNA含量的檢測 采用PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測宮頸鱗癌組織HPV DNA含量，應(yīng)用HPV-DNA檢測試劑盒（深圳亞能生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行HPV-DNA提取、PCR擴(kuò)增、雜交、洗膜及顯色。

1.2.2 結(jié)果判讀 陽性質(zhì)控品雜交膜條在相應(yīng)的HPV基因型位點(diǎn)及IC位點(diǎn)出現(xiàn)顯色信號（藍(lán)色斑點(diǎn)），其他位點(diǎn)不顯色；陰性質(zhì)控品雜交膜條除IC位點(diǎn)出現(xiàn)顯色信號外，其他位點(diǎn)不顯色。按照膜條上探針排列順序，依據(jù)顯色信號的有無判讀結(jié)果，依據(jù)顯色信號的位置判定HPV基因型。

1.2.3 宮頸鱗癌及宮頸病變組織中c-fos蛋白表達(dá)的檢測 采用免疫組織化學(xué)PV二步法檢測宮頸鱗癌及宮頸病變組織中c-fos蛋白表達(dá)，一抗為c-fos兔抗多克隆抗體，稀釋濃度為1︰100，以PBS代替一抗做為陰性對照，已知陽性結(jié)果做陽性對照。c-fos抗體和免疫組織化學(xué)試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。采用陽性細(xì)胞的百分率評分和染色強(qiáng)度評分進(jìn)行結(jié)果判定，每個(gè)標(biāo)本選取6張切片，每張切片均隨機(jī)取3個(gè)視野測量，取平均值。①陽性細(xì)胞百分率評分標(biāo)準(zhǔn)：無表達(dá)或陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分，＜5%=0分，6%～25%=1分，26%～50%=2分，≥51%=3分；②染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：基本不染色=0分，染色較淺=1分，染色適中=2分，染色較深=3分。將陽性細(xì)胞百分率評分和染色強(qiáng)度評分得分之和作為最后得分：≤1分為陰性（-）；2分為弱陽性（+），3～4分為陽性（++），5～6分為強(qiáng)陽性（+++）。按抗體說明書標(biāo)示，c-fos蛋白主要表達(dá)于胞核，偶爾散在表達(dá)于胞質(zhì)，單純胞質(zhì)表達(dá)不視為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，等級資料采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染與宮頸鱗癌臨床特征陽性的關(guān)系

HPV在49例宮頸鱗癌組織中的表達(dá)率為89.8%，PCR-反向點(diǎn)雜交方法檢測結(jié)果顯示：膜條上分別于16、35、58位點(diǎn)出現(xiàn)顯色信號，即宮頸鱗癌患者HPV感染主要為HPV16型，少數(shù)為HPV35型和HPV58型。不同年齡、腫瘤分級及臨床分期患者宮頸鱗癌組織中HPV感染比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HPV感染與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1和表1。

2.2 宮頸鱗癌及宮頸病變組織中c-fos蛋白表達(dá)情況

圖1 宮頸鱗癌組織中HPV分型檢測結(jié)果

表1 宮頸鱗癌組織中HPV感染與臨床病理特征的關(guān)系

c-fos蛋白在慢性宮頸炎、LSIL、HSIL及宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中均有表達(dá)。c-fos蛋白表達(dá)隨宮頸病變的程度逐漸增加，經(jīng)Spearman等級相關(guān)性分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2和表2。

圖2 各組宮頸病變組織中c-fos蛋白表達(dá)情況

表2 各組宮頸病變組織中c-fos蛋白表達(dá)情況

2.3 c-fos蛋白表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

Ⅰ、Ⅱ期宮頸癌組織中c-fos蛋白表達(dá)陽性率與Ⅲ、Ⅳ期癌組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Ⅰ、Ⅱ期低于Ⅲ、Ⅳ期；c-fos蛋白在高、中、低分化腫瘤組織中出現(xiàn)異常表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組c-fos蛋白表達(dá)與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；c-fos蛋白表達(dá)與患者年齡無相關(guān)（P＞0.05）。見表 3。

2.4 HPV感染與c-fos蛋白表達(dá)的相關(guān)性

在宮頸鱗癌組織中（49例），HPV陽性患者（44例）c-fos蛋白陽性表達(dá)34例，陽性表達(dá)率為77.3%（34/44），HPV陰性患者（5例）c-fos蛋白陽性表達(dá)1例，陽性表達(dá)率為20.0%（1/5），兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.680，P=0.003）。

表3 宮頸鱗癌組織中c-fos蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

宮頸癌是一種可以通過早期篩查、早期干預(yù)有效降低發(fā)病率及病死率的一種疾病[4]。而在我國對于宮頸病變的篩查重視程度不足，加上受到地區(qū)、技術(shù)條件、費(fèi)用等方面的限制，造成宮頸病變的篩查并不規(guī)范，這使得宮頸病變發(fā)生進(jìn)展，進(jìn)而向癌變的方向轉(zhuǎn)化，因此導(dǎo)致我國宮頸癌的病死率仍居高不下，并且逐漸呈現(xiàn)年輕化的趨勢，嚴(yán)重影響了女性的健康。

c-fos是fos家族中研究最多的基因之一，其可作為調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡的重要基因。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激使核內(nèi)c-fos激活時(shí)，其轉(zhuǎn)錄的mRNA由胞核進(jìn)入胞漿，轉(zhuǎn)錄出蛋白質(zhì)后返回胞核與c-jun蛋白形成轉(zhuǎn)錄激活蛋白1（activator protein-1, AP-1），AP-1通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信號通路在與基因啟動子和增強(qiáng)子相互作用的誘導(dǎo)下，導(dǎo)致下游靶基因的過表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化，促使腫瘤的形成進(jìn)展[5]。目前研究表明，c-fos過表達(dá)或異常表達(dá)與卵巢癌、食管癌、胃癌、甲狀腺癌、大腸癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[6-7]。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測c-fos蛋白在宮頸鱗癌及宮頸病變黏膜組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)c-fos蛋白陽性表達(dá)率隨著宮頸病變程度的加重而逐漸增加。說明c-fos基因的過度激活在宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。在宮頸鱗癌組織中，c-fos蛋白表達(dá)與癌組織的分級、臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，c-fos參與了宮頸鱗癌的分化、轉(zhuǎn)移過程。c-fos表達(dá)越明顯，宮頸鱗癌的惡化、轉(zhuǎn)移的潛在可能性也越強(qiáng)。因此，c-fos可能為預(yù)測宮頸鱗癌惡化、轉(zhuǎn)移提供新的靶點(diǎn)。

HPV持續(xù)感染在宮頸上皮內(nèi)瘤變過程中發(fā)揮著重要的作用，而其中HPV16和HPV18是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的兩個(gè)重要亞型。宮頸病變細(xì)胞內(nèi)染色體常通過HPV基因的整合啟動E1、E2基因的表達(dá)，而E6、E7癌基因與抑癌基因的結(jié)合并使其失活可促進(jìn)宮頸上皮病變的發(fā)生[8-10]。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，體內(nèi)細(xì)胞在受到HPV感染后，體內(nèi)c-fos與c-jun表達(dá)升高，激活A(yù)P-1信號通路，并通過調(diào)控下游靶基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、血管的形成、腫瘤的轉(zhuǎn)移等。本研究通過PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測宮頸鱗癌組織中HPV-DNA含量，發(fā)現(xiàn)HPV在宮頸癌組織中的表達(dá)率高達(dá)89.8%，主要為HPV16型，少數(shù)為HPV35型和HPV58型，與以往研究結(jié)果一致。推測HPV感染可能是導(dǎo)致宮頸癌變的重要因素之一。在宮頸癌組織中，HPV陽性患者c-fos蛋白表達(dá)率均高于HPV陰性患者，提示c-fos的表達(dá)增強(qiáng)進(jìn)而激活A(yù)P-1信號通路可能是HPV感染后引發(fā)宮頸癌重要因素，但確切機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。因此，聯(lián)合檢測HPV與c-fos蛋白表達(dá)有望成為宮頸病變的早期篩查、預(yù)后評判及治療的新手段。