MicroRNA-9和microRNA-210檢測聯合彩色多普勒超聲診斷乳腺癌的價值*

徐靜，努爾蘭·吐爾遜，王士光，王萍，謝芳

[1.四川省人民醫院東院 超聲科，成都 610101；2.新疆醫科大學第三臨床醫院（附屬腫瘤醫院） 影像中心，新疆 烏魯木齊 830011；3.川北醫學院附屬醫院超聲科，四川 南充 637000]

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。超聲是最常用的影像學診斷方法之一，目前多應用美國放射學會超聲乳腺影像報告和數據系統（BI-RADS）給乳腺腫塊進行評分，但該系統分級所涉及的項目仍主要依賴醫生的主觀經驗[1-2]。腫瘤標志物的檢測客觀性較好，其中人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）的蛋白表達與基因擴增狀態已成為乳腺癌選擇臨床治療方案與判斷預后的重要標準[3-4]，但其單項檢測的敏感性有限，漏診率大。因此探索更具特異性和敏感性的早期診斷方法具有重要的臨床應用價值。近年來，微RNA（microRNA,miRNA）在癌癥的發生、轉移和增殖中的作用得到了進一步地探索，SUN等[5]研究顯示miR-9在肝細胞癌、乳腺癌等中表達顯著升高。TOYAMA等[6]研究表明，miR-210的高表達是日本三重陰性乳腺癌患者預后不良的獨立因素。楊浚沨等[7]研究顯示，miRNA聯合診斷乳腺癌比HER2等單一指標診斷具有更大的優勢。但尚未有研究表明miRNA檢測與影像學手段聯合是否具有更高的診斷價值。因此，本研究利用miR-9、miR-210和彩色多普勒超聲對乳腺癌進行聯合診斷，旨在為臨床早期診斷、篩查乳腺癌提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2015年3月至2018年3月四川省人民醫院東院乳腺外科收治的患者。均經該院病理科術后病理確診。確診為乳腺惡性腫瘤的患者175例（乳腺癌組），其中，浸潤性癌168例（浸潤性導管癌165例、浸潤性小葉癌3例）、導管內癌7例；平均年齡（51.01±7.18）歲；均為女性。確診為乳腺良性病變的患者162例（良性病變組），其中，乳腺上皮增生94例（腺病86例、乳腺小葉增生4例、乳腺上皮不典型增生4例）、上皮良性腫瘤62例（單純纖維腺瘤45例、導管內乳頭狀瘤17例）、脂肪瘤5例、感染性肉芽腫1例；平均年齡（50.80±6.91）歲；均為女性。納入標準：①患者術后病理診斷明確；②所有患者術前均未接受放化療；③精神狀態良好，生命體征平穩，能配合研究者。排除標準：合并其他惡性腫瘤、嚴重心腦血管疾病、肝腎功能不全及內分泌失調疾病等。本研究獲該院倫理委員會批準，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

德國GE LOGIQ E9彩色多普勒超聲診斷儀，離心機購自美國Sigma公司，PCR儀購自美國BIO-RAD公司。miRNeasy Mini Kit試劑盒（德國QIAGEN公司），All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒（美國GeneCopoeia公司），ELISA定量試劑盒（美國Bender公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 超聲檢查 使用GE LOGIQ E9彩色多普勒超聲診斷儀，ML6-15探頭，頻率為6～15 MHz。患者取仰臥位，充分暴露雙側乳腺、腋窩及鎖骨上窩，常規超聲掃描，探頭分別做縱向、斜向、橫向及多方位掃查，觀察各乳腺病灶的形狀、走行、邊緣、回聲、周圍組織、鈣化、病變內血管血流的阻力指數（resistance index,RI）等征像并記錄。根據上述情況，參照BI-RADS分級診斷標準進行分級評價[8-9]：0級，資料不完善，需結合其他檢查進行診斷；1級，未見明顯異常；2級，良性改變，建議定期隨訪；3級，良性病變可能，建議短期隨訪；4級，可疑惡性病變（惡性概率3%～94%），建議活檢以確診；5級，高度可疑惡性病變（惡性概率＞95%）；6級，病理已確診為惡性。因此，在本研究中，認為1～3級為良性改變，4～5級為惡性病變。

1.3.2 miR-9、miR-210檢測 采集患者手術前空腹靜脈血液標本5 ml，加入促凝管，4℃條件下4 000 r/min離心10 min，再置于4℃條件下12 000 r/min離心15 min，分離血清。分離后的血清暫時放至-80℃冰箱冷凍保存。取100～200 μl血清，按照miRNeasy Mini Kit試劑盒說明書提取血清總RNA。然后按照All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒說明書進行RNA逆轉錄，并qRT-PCR檢測血清miR-9、miR-210濃度，表達水平的對比以U6B濃度作為內參對照。

1.3.3 HER2檢測 采集患者手術前空腹靜脈血樣，3 500 r/min離心5 min，取上清。按照ELISA定量試劑盒說明書操作，1∶20稀釋待檢血清，配置標準曲線，室溫搖育2 h。酶標儀讀取光密度（OD）值，繪制標準曲線，得出每個樣品濃度，血清HER2＞15 ng/ml為陽性，≤15 ng/ml為陰性。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0和Medcalc統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，計數資料使用例數表示，采用χ2檢驗。比較采用Logistic回歸進行乳腺癌的影響因素分析，建立受試者工作特征曲線（ROC）分析潛在指標診斷乳腺癌的準確性，利用Logistic回歸建立彩色多普勒超聲與miR-9、miR-210檢測聯合診斷模型。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較

圖1 乳腺良惡性腫瘤的多普勒超聲聲像圖

兩組均可觸及無痛性腫塊（共310例，占91.98%），多位于外上象限（共154例，占45.69%），腫塊質地多較硬，也可為囊性或有柔韌感；腫塊較為固定，活動度小。乳腺癌組患者可有乳頭濕疹樣改變，回縮固定（乳腺癌組32例，占19.75%）；乳房皮膚橘皮樣改變（乳腺癌組21例，占12.96%）等。超聲結果示：乳腺癌組腫塊邊界不清，呈鋸齒狀或蟲蝕樣向周圍組織浸潤，腫塊邊緣有厚薄不均的強回聲暈環；腫塊內部為弱回聲或低回聲，有小鈣化或液化，內部和周邊可探及豐富血流信號（見圖1A）。良性病變組腫塊邊界相對清晰，腫塊內回聲較為均勻，內部和周邊多無豐富血流信號（見圖1B）。

乳腺癌家族史、月經周期不規律、BI-RADS分級惡性、HER2陽性在乳腺癌組中所占比例大于在良性病變組中的比例，差異有統計學意義（P＜0.05）。RI值、miR-9、miR-210表達水平在乳腺癌組中均高于良性病變組，差異有統計學意義（P＜0.05）。年齡在兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 乳腺癌的危險因素

以患者是否患乳腺癌為因變量，進一步分析患者乳腺癌家族史、月經周期不規律、BI-RADS分級惡性、RI值、HER2及miR-9、miR-210表達水平對乳腺癌準確診斷的影響程度，多因素Logistic分析結果顯示：乳腺癌家族史、月經周期不規律、BI-RADS分級惡性、HER2及miR-9、miR-210表達水平對乳腺癌發生有影響，差異有統計學意義（P＜0.05）；分析各因素對乳腺癌準確診斷的影響程度，BI-RADS分級的影響程度最高（O^R=5.702），其次為HER2陽性（O^R=4.371）。見表2。

表1 兩組患者一般資料比較

表2 乳腺癌危險因素的多因素分析

2.3 HER2、彩色多普勒超聲、miR-9和miR-210診斷乳腺癌的敏感性、特異性比較

以病理結果為金標準，HER2診斷宮頸癌的敏感性為59.43%（104/175），特異性為27.78%（45/162）。彩色多普勒超聲診斷宮頸癌的敏感性為83.43%（146/175），特異性為69.14%（112/162）。血清miR-9診斷宮頸癌的AUC為0.753，敏感性為50.99%，特異性為90.63%。血清miR-210診斷宮頸癌的AUC為0.747，敏感性為51.08%，特異性94.21%（見圖2）。

2.4 彩色多普勒超聲聯合miR-9、miR-210檢測診斷乳腺癌

利用Logistic回歸模型將彩色多普勒超聲與血清miR-9、miR-210檢測進行聯合診斷，其AUC提高到0.934，敏感性為89.78%，特異性為85.12%。見圖3。

圖2 血清miR-9、miR-210檢測診斷乳腺癌ROC曲線

圖3 彩色多普勒超聲聯合血清miR-9、miR-210診斷乳腺癌ROC曲線

3 討論

目前臨床上常用鉬靶X射線攝影作為乳腺癌篩查的主要手段，但是鉬靶X射線不能檢出較小的乳腺癌腫塊，且對致密腺體顯影較差，不利于乳腺惡性腫瘤的早期診斷。雖然彩色多普勒超聲可以彌補這一不足，但其對病變性質的區別能力較低，并且應用于臨床的BI-RADS標準多依賴于醫生的主觀判斷。近年來，基因檢測成為乳腺惡性腫瘤研究的新興熱點，miRNA的出現為乳腺癌的篩查與早期診斷提供了新的方向。然而miRNA進行乳腺癌的早期診斷時，其敏感性較影像學手段低，且缺乏多中心大樣本量的研究支持。因此，本研究選取與乳腺癌發生密切相關的miR-9和miR-210作為標志物，聯合彩色多普勒超聲，旨在為乳腺癌提供準確、高效的篩查和早期診斷方式。

通過對兩組一般資料的比較發現，乳腺癌組和良性病變組都有較高比例的乳腺癌家族史，且乳腺癌組有家族史人群比例更高，這與乳腺癌的遺傳易感性相符[10]；月經周期不規律常與雌孕激素的失調有關，在乳腺癌組中更高比例的月經不規律發生例數也印證該點[11]。在本研究中，彩色多普勒超聲可以顯示大部分腫瘤內有典型的豐富血流、腫塊邊緣有厚薄不均的強回聲暈環等特點，但部分良性病變患者亦可見局部血流豐富，因此需要有經驗的醫生進行辨別，而其敏感性和特異性受限。乳腺癌組中RI值較良性病變組低，表明腫瘤內有豐富血流，而RI值并不受醫生經驗的影響，具有更客觀的特點。

新近有研究表明[12-13]，miR-9或miR-210與胃、肺、乳腺等多種腫瘤的臨床分期、淋巴結轉移和預后存在密切的關系。本研究顯示，相較于良性病變組，乳腺癌組的血清miR-9、miR-210表達量顯著升高，與既往研究一致[14]。

在多因素分析中，乳腺癌家族史、月經周期不規律、BI-RADS分級惡性、HER2表達水平、miR-9和miR-210的表達水平均為乳腺癌發生的影響因素。然而根據臨床經驗，問診得到的乳腺癌家族史、月經規律與否等信息存在一定的偏差，而HER2表達水平的敏感性低[15]，故無法作為篩查乳腺癌的主要手段。因此本研究探討miR-9、miR-210檢測聯合彩色多普勒超聲診斷乳腺癌的診斷效能。

根據ROC曲線，分別分析彩色多普勒超聲、血清miR-9、miR-210水平診斷乳腺癌的診斷效能，發現彩色多普勒超聲檢查敏感性較好，但依賴于醫生的主觀判斷。血清miR-9、miR-210的AUC均在0.75左右，但其敏感性和特異性無法兼顧。兩者聯合檢測可以有效提高診斷的準確性，AUC提高至0.934，敏感性為89.78%，特異性為85.12%，綜合效能較獨立診斷較好。因此，miR-9、miR-210檢測聯合彩色多普勒超聲診斷乳腺癌具有較好的診斷效能。

綜上所述，miR-9和miR-210檢測聯合彩色多普勒超聲診斷乳腺癌準確性較高，是一種無創而高效的篩查和早期診斷方法，具有較高的臨床價值，值得參考與借鑒。