雷洛昔芬聯合仙靈骨葆對骨質疏松骨微結構和生物力學性能的影響

王麗隨 范哲華 陳海英*

1. 福建莆田市第一醫院藥劑科，福建 莆田 351100 2. 福建莆田學院，福建 莆田 351100

骨質疏松癥是一種中老年人常見的骨量低、骨組織微結構損壞的骨骼疾病，絕經后女性發病率明顯高于男性[1]。絕經后骨質疏松癥目前常用的雌激素替代療法(HRT)會增加子宮內膜癌和乳腺癌的發生率。雷洛昔芬屬于選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，對骨組織有雌激素樣功效，保持骨量和增加骨礦鹽密度，但對子宮、乳腺有抗雌激素功效[2]，可替代雌激素防治絕經后骨質疏松癥。仙靈骨葆含淫羊藿、續斷等中藥成分，能增加骨密度、促進骨形成、抑制骨吸收、促進骨重建，且不刺激子宮[3]。目前關于雷洛昔芬和仙靈骨葆對大鼠骨質疏松骨微結構和骨生物力學性能影響的研究較少，本研究選取雷洛昔芬和仙靈骨葆作為干預因素，通過觀察骨質疏松大鼠骨微結構及大鼠骨生物力學性能的改變情況，探討雷洛昔芬和仙靈骨葆調控骨吸收與骨形成及其防治絕經后骨質疏松癥的作用機制。

1 材料和方法

1.1 大鼠骨質疏松模型的建立

選用清潔級6月齡SD雌性大鼠40只，體重200～220 g，由福州吳氏動物中心提供。適應性喂養1周，摘除大鼠雙側卵巢，飼養3個月建立標準骨質疏松動物模型。隨機分為正常對照組、假手術組、模型組、干預1組，干預2組，每組8只。干預1組大鼠給于雷洛昔芬(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)6.2 mg/(kg·d)溶于2 mL注射用水形成溶液后經口灌胃，干預2組大鼠給于雷洛昔芬(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)6.2 mg/(kg·d)聯合仙靈骨葆(貴州同濟堂制藥有限公司)250 mg/(kg·d)溶于2 mL注射用水形成溶液后經口灌胃，正常組、假手術組、模型組給于經口灌胃注射用水。飼養12周。

1.2 骨標本的制備

組織學觀察及圖象分析：25%的烏拉坦麻醉后取股骨，4%多聚甲醛固定、脫水脫脂、脫鈣、包埋(冠狀面)，酸處理，烘干。切片機(德國 Leica RM2015)連續切片(厚度4 μm)。HE染色，光學顯微鏡(日本Olympus BX51T-PHD-J11)觀察。進行200×和400×的顯微照相，編號、采集存盤。觀察并測量骨小梁。同樣要求在不同多個視野各測定一次，取平均值。

1.3 Van Gieson膠原纖維染色

切片以Van Gieson進行膠原纖維染色，光鏡下觀察膠原纖維沉積情況。

1.4 血清蛋白聚糖檢測

大鼠麻醉后腹主動脈取血，室溫下離心 10 min，取上清液-80 ℃ 保存。采用比利時 Bisoure 公司生產的蛋白聚糖 ELISA 試劑盒，按說明書操作，蛋白聚糖測定免疫化學原理為間接夾心法。

1.5 生物力學實驗

股骨三點彎曲力學試驗及股骨生物力學指標測定：將所有右側股骨置于 Instron 萬能材料力學測試裝置上作三點彎曲實驗，中央垂直施加載荷，以1 mm /min 的速度對股骨緩慢勻速加載直至股骨斷裂。軟件自動記錄，數據分析換算得出最大載荷(FM)。

1.6 統計學處理

統計學分析測定和計量數據采用SPSS13.0統計軟件進行。在該實驗中，各組的個體之間相互獨立，不存在聯系，是獨立樣本。此外，樣本均數都來自正態分布總體，樣本符合正態分布。因此，采用兩個獨立樣本t檢驗比較組間差異，P<0.01表示差異有顯著統計學意義。但是獨立樣本t檢驗包含兩種情況。情況一：當兩總體方差相等時，即方差齊性。按兩獨立樣本數據的均值比較的檢驗進行分析。情況二：當兩總體方差不相等，不滿足方差齊性，即方差不齊。要使用校正的t檢驗方法，此時需要校正t值與自由度值。

2 結果

2.1 各組骨組織形態學比較

正常對照組和假手術組股骨骨小梁粗大稍厚，未見吸收或斷裂現象 (圖1 A、圖1B)。模型組骨小梁排列稀疏變薄、骨髓腔變大、間距增大、結構紊亂，部分骨小梁斷裂?？梢娍杖惫窍莞C(圖1C)。干預1組骨小梁較多較厚，未見骨小梁斷裂，可見少量空缺骨陷窩(圖1D)。干預2組骨小梁的量遠遠大于對照組組，且骨小梁之間聯系緊密(圖1E)。

圖1 各組骨組織形態學Fig.1 Bone histomorphometry

2.2 骨膜膠原代謝的改變

Van Gieson染色結果：正常對照組和假手術組骨基質膠原纖維染色深，緊致有序(圖2 A、圖2B)。模型組骨基質膠原纖維松散，染色淺，排列稀疏 (圖2C)。干預1組骨基質膠原纖維積聚、緊密排列，方向有序(圖2D)。干預2組骨基質增厚增寬，膠原纖維積聚(圖2E)。

圖2骨膜膠原代謝的改變Fig.2 The change of collagen metabolism in the bone

2.3 組織計量學指標測定統計學結果

與對照組相比：假手術組沒有出現明顯改變。模型組骨小梁厚度(Tb.Th)明顯下降(均P<0.05)。干預1組Tb.Th明顯升高(均P<0.05)。干預2組Tb.Th明顯升高(P<0.05)(圖3)。

圖3各組骨小梁厚度Fig.3 Comparison of Tb.Th

2.4 骨膜膠原面密度積分統計學結果

與對照組相比，假手術組膠原面密度積分沒有出現明顯改變。模型組膠原面密度積分明顯下降(均P<0.05)。干預1組膠原面密度積分明顯升高(均P<0.05)。干預2組膠原面密度積分明顯升高(P<0.05)。

2.5 血清蛋白聚糖測定

與對照組相比，假手術組血清蛋白聚糖含量沒有出現明顯改變。模型組血清蛋白聚糖活性明顯升高(均P<0.05)。干預1組血清蛋白聚糖含量明顯下降(均P<0.05)。干預2組血清蛋白聚糖含量明顯下降(P<0.05)(圖4)。

圖4各組血清蛋白聚糖含量Fig.4 Serum proteoglycan

2.6 各組大鼠右股骨三點彎曲測試結果

與對照組相比，假手術組右股骨三點彎曲測試最大載荷(FM)沒有出現明顯改變。模型組最大載荷(FM)明顯下降(均P<0.05)。干預1組最大載荷(FM)明顯升高(均P<0.05)。干預2組最大載荷(FM)明顯升高(P<0.05) (圖5)。

圖5各組生物力學最大載荷Fig.5 The maximal load (FM) of biomechanical property)

3 討論

機體的成骨細胞、骨細胞前體及破骨細胞上都存在雌激素受體，與女性絕經后雌激素下降導致的骨質疏松癥具有相關性。雷洛昔芬是SERM的第二代非甾體苯并噻吩衍生物，可通過選擇性地與骨細胞上的雌激素受體結合發揮作用，調節骨的形成、吸收與重建[2]；能增加骨密度，但不增加子宮內膜癌和乳腺癌的發生率[4]。謝江濤等[5]研究表明雷洛昔芬可減慢骨質丟失，顯著改善顯著改善去勢大鼠骨材料力學和結構力學性能，維持較好的骨生物力學性能，防治骨質疏松癥安全可靠。

仙靈骨葆具有植物雌激素樣功能[3]，可改善骨轉換，增加骨密度，抑制骨量流失[6]；還可促進成骨細胞增殖，優化骨小梁結構，改善骨質疏松癥狀[7]，不增加子宮肌瘤等疾病的風險[8]。朱太詠等[9]研究表明仙靈骨葆能提高股骨生物力學應答調節功能，改善骨力學結構，增強骨強度，有效預防骨折。

本實驗結果顯示，雷洛昔芬聯合仙靈骨葆組相比雷洛昔芬組，其防治骨質疏松癥更具優勢，更有效地提髙骨質疏松動物局部骨密度，實驗提示增加骨小梁的數量、厚度，增加骨股最大載荷，增強骨的生物力學強度；骨基質膠原纖維更積聚有序，膠原面密度積分升高更明顯；血清蛋白聚糖含量下降更明顯。骨小梁體積占全部骨組織體積百分比增加，反映了經雷洛昔芬聯合仙靈骨葆組治療后骨量增加，骨強度增強，骨股最大載荷也增大，有效改善其骨微結構，有效阻止生物力學性能受損。在骨基質礦化、骨質的形成與吸收、骨細胞的增值與分化等過程中，骨基質膠原纖維起著重要的作用，膠原面密度積分升高，在骨骼中相互交錯，呈網狀排列，為骨基質中無機物羥基磷灰石晶體提供沉積位點，對骨骼系統產生明顯的影響。謝江濤等[5]表示骨膠原纖維結構的改變及其性能下降都會導致骨生物力學性能的下降。另鑒于骨組織的生物學特性，骨生物合成的研究經常采用軟骨組織進行研究[10]，骨質疏松癥與蛋白聚糖關系密切，蛋白聚糖在維持骨功能中起著非常重要的調節和控制作用，其代謝與骨基質發育和退變等有著密切的關系，可促進軟骨鈣化來防治骨質疏松癥[11]。在生理條件下，蛋白聚糖帶負電荷，可結合Ca2+、Na+、K+等陽離子，能捕捉固定金屬離子、半受體和生長因子等，并很大程度地影響它們在基質中的分布、傳遞和維持骨的功能及形狀。蛋白聚糖與膠原纖維兩者都決定骨的韌性及其抗壓負荷的程度等。

雷洛昔芬是選擇性雌激素受體調節劑，可代替雌激素防治絕經后骨質疏松癥，安全可靠。仙靈骨葆可以通過調整人體的整體功能，調節體內多個系統，治療骨質疏松[12]。雷洛昔芬聯合仙靈骨葆防治絕經后骨質疏松癥，中西結合，取長補短，既可增強療效，又可減少不良反應，較單獨使用雷洛昔芬具有更好的防治效果，更安全有效。

本研究具有局限性，我們還需要進一步探索骨骼生化性能變化，及其發生機制，進一步確定最佳治療劑量等等。