Wnt信號通路中DKK1、β-catenin基因在絕經(jīng)后女性2型糖尿病患者中的表達(dá)及與骨代謝關(guān)系的研究

胡倩 周瓊 李軍* 李思源 胡穎 李佳佳

1.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，新疆 石河子 832000 2.新疆第二師二十九團(tuán)醫(yī)院，新疆 庫爾勒 841000 3.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000 4.新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000

糖尿病是一種易合并多種并發(fā)癥的慢性代謝性疾病，且2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的發(fā)病人數(shù)約占全部糖尿病患者的90%以上。骨質(zhì)疏松是T2DM的常見并發(fā)癥，絕經(jīng)是糖尿病和骨質(zhì)疏松癥的已知危險因素，絕經(jīng)后女性T2DM患者較一般人群更易合并骨量異常，甚至骨質(zhì)疏松(osteoporosis, OP)[1]。目前，骨質(zhì)疏松癥(OP)和2型糖尿病(T2DM)被認(rèn)為是兩個主要的健康問題，兩種疾病在老年人群中都有越來越高的患病率。

Wnt信號通路為高度保守的信號通路，是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性及生成的重要通路，目前研究較為清楚且被廣為關(guān)注的是Wnt/β-catenin信號通路。DKK1是一種分泌性糖蛋白，主要通過與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/ LRP6)受體及Kremen-1/2結(jié)合成復(fù)合物而阻斷Wnt信號傳導(dǎo)，是Wnt經(jīng)典信號通路的重要抑制劑[2]。許多研究表明阻斷DKK1的功能有利于骨形成和防止系統(tǒng)性骨量丟失[3]。本研究通過測定絕經(jīng)后女性T2DM患者外周血Wnt信號通路中DKK1、β-catenin基因的表達(dá)并分析其與骨代謝的關(guān)系，從基因水平闡明T2DM合并骨代謝異常的發(fā)病機制，有利于絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松的防治。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取2015年10月至2016年10月石河子地區(qū)社區(qū)及于我院就診的絕經(jīng)后女性為研究對象，根據(jù)OGTT試驗結(jié)果，分為T2DM組、NGT組，每組50人。該實驗已通過石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，納入對象均簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

T2DM的診斷符合1999年WHO制定的糖尿病診斷準(zhǔn)則，OP的診斷符合1994年WHO骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時排除1型糖尿病、特殊類型糖尿病、自身免疫性疾病；影響骨代謝的各種因素；雌激素、降鈣素、維生素K等影響骨代謝的藥物服用史及其他先天性骨質(zhì)疏松癥。

1.3 方法

1.3.1常規(guī)指標(biāo)的測定：由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的工作人員按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)對受試者進(jìn)行常規(guī)指標(biāo)的測量，包括年齡(age)、身高(height)、體重(weight)，并計算體質(zhì)指數(shù)(BMI)=體重(kg)/身高2(m2)。

1.3.2一般生化指標(biāo)的測定：全自動生化分析儀(7071型，日本日立株式會社)測定空腹血糖(FPG)、果糖胺(FMN)、鈣(Ca)、磷(P)等生化指標(biāo)。

1.3.3骨密度的測定：雙能X線骨密度檢測儀(法國MEDI LINK公司)測定腰椎及股骨骨密度。

1.3.4DKK1, β-catenin基因的測定：實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad CFX96 Manager? Thermo公司) 測定DKK1, β-catenin基因的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組間一般資料的比較

對絕經(jīng)后女性NGT組和T2DM組年齡以及體質(zhì)指數(shù)(BMI)進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，說明資料齊，具有可比性(見圖1)。

圖1 T2DM組與NGT組年齡及BMI比較情況Fig.1 Comparison of age and BMI between T2DM group and NGT group

2.2 兩組間生化指標(biāo)的比較

與絕經(jīng)后女性NGT組相比，T2DM組糖代謝指標(biāo)：FPG、FMN、HbA1c水平較高(P<0.01)；骨代謝指標(biāo)：P水平較高(P<0.01)。見表1。

指標(biāo) NGT組 T2DM組P值FPG/(mmol/L)5.47±0.739.26±2.38**<0.001FMN/(μmol/L)239.74±36.54337.66±87.31**<0.001HbA1c/%6.23±0.928.70±1.76**<0.001Ca/(mmol/L)2.26±0.082.28±0.080.277P/(mmol/L)1.11±0.121.24±0.16**<0.001ALP/(U/L)76.85±18.0573.68±24.330.541

注：與NGT組比較，**P<0.01。

2.3 兩組間骨密度情況的比較

T2DM組股骨(femur)BMD較NGT組顯著降低(P<0.05)，余部位無統(tǒng)計學(xué)差異。見表2。

表2NGT組與T2DM組不同部位骨密度比較(g/cm2)

Table2Comparison of bone mineral density in different parts between NGT group and T2DM group(g/cm2)

指標(biāo) NGT組 T2DM組P值L10.93(0.81, 1.02)0.91(0.81, 1.00)0.673L20.99(0.87, 1.12)0.92(0.86, 1.10)0.165L31.061(0.93, 1.15)1.00(0.90, 1.16)0.258L41.10(0.95, 1.24)1.03(0.90, 1.23)0.432L1-L41.00(0.88, 1.12)0.99(0.87, 1.10)0.448Femoral neck0.99(0.78, 1.23)1.02(0.92, 1.11)0.553Femur0.87(0.80, 0.95)0.80(0.61, 0.90)**0.003

注：與NGT組比較，**P<0.01。

2.4 兩組間DKK1基因表達(dá)水平的比較

與絕經(jīng)后女性NGT組相比，T2DM組DKK1基因表達(dá)水平較高，外周血白細(xì)胞qRT-PCR數(shù)據(jù)經(jīng)2-△△Ct計算：(1, 5.99)，T2DM組DKK1基因表達(dá)水平為NGT組的5.99倍(P<0.05)見圖2。

圖2 T2DM組與NGT組白細(xì)胞內(nèi)DKK1表達(dá)情況Fig.2 Dkk1 expression in white blood cells in T2DM and NGT groups

2.5 兩組間β-catenin基因表達(dá)水平比較

與絕經(jīng)后女性NGT組相比，T2DM組β-catenin基因表達(dá)水平顯著降低，外周血白細(xì)胞qRT-PCR數(shù)據(jù)經(jīng)2-△△Ct計算：(1, 0.46)，T2DM組β-catenin基因表達(dá)水平為NGT組的0.46倍，見圖3。

圖3 T2DM組與NGT組白細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)情況Fig.3 Expression of β-catenin in white blood cells of T2DM and NGT groups

2.6 T2DM組中β-catenin基因與骨代謝指標(biāo)相關(guān)性分析

分析絕經(jīng)后女性2型糖尿病患者β-catenin基因與骨代謝指標(biāo)相關(guān)性，分析結(jié)果顯示，在絕經(jīng)后女性T2DM組中，β-catenin基因與P呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表3。

表3β-catenin基因與骨代謝指標(biāo)相關(guān)性分析

Table3Correlation analysis between β-catenin gene and bone metabolism indexes

指標(biāo)CaPALPβ-cateninr -0.146-0.287*0.123geneP 0.3110.0430.396

注：*P<0.05。

2.7 以骨代謝指標(biāo)為應(yīng)變量進(jìn)行多元線性回歸分析

以骨代謝指標(biāo)(Ca，P，ALP)為應(yīng)變量，以DKK1基因和β-catenin基因為自變量，進(jìn)行多元線性逐步回歸分析，在T2DM組中，β-catenin基因進(jìn)入以P為應(yīng)變量的回歸方程，其他指標(biāo)未進(jìn)入回歸方程。而在NGT組中，所有指標(biāo)均未進(jìn)入回歸方程。由表4可建立以P為應(yīng)變量的回歸方程：Y=1.445-0.287X。

表4以骨代謝指標(biāo)為應(yīng)變量的多元線性回歸分析

Table4Multivariate linear regression analysis with bone metabolic indexes as dependent variables

變量B標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)t值P值常量1.44514.165<0.001β-catenin gene-0.010-0.287-2.0780.043

3 討論

眾多研究均表明糖尿病患者易合并骨代謝異常[4]。糖尿病患者由于血糖的升高會抑制胰島素樣生長因子(IGF-I)的生成，從而減弱其成骨作用；胰島素分泌不足或缺乏會影響成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨吸收，進(jìn)而對骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[5- 6]。絕經(jīng)后女性由于卵巢功能的衰退，雌激素產(chǎn)生及分泌減少，激素水平的異常影響骨代謝，使成骨細(xì)胞生成減少，而破骨細(xì)胞生成增多，骨的吸收大于骨的形成作用，因此絕經(jīng)后女性更易發(fā)生骨折疏松[7]。然而，目前絕經(jīng)后女性2型糖尿病患者骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制尚不明確。

研究表明，Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路在成骨細(xì)胞分化和功能上起著關(guān)鍵作用, Wnt信號通路激活不僅通過刺激成骨細(xì)胞的發(fā)生進(jìn)而增加骨量，同時也抑制著破骨細(xì)胞的發(fā)生[8]。DKK1作為DKK家族中最好的特征成員之一，是經(jīng)典Wnt /β-catenin信號通路的強有力的抑制劑。Ahmed等[9]的研究結(jié)果顯示血清DKK1明顯升高的絕經(jīng)后婦女有更嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松，表明較高水平的DKK1可能是骨質(zhì)疏松發(fā)生和嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。相關(guān)研究[10-11]表明，外周血Wnt通路中DKK1、β-catenin表達(dá)水平對骨組織Wnt及骨代謝有重要影響，這與本研究結(jié)果相符。

Corrado等[12]的研究結(jié)果表明，與健康人群相比，骨質(zhì)疏松患者DKK1表達(dá)水平增高，β-catenin表達(dá)水平降低，DKK1的高表達(dá)抑制了β-catenin信號，使軟骨生成和骨生成減少。研究發(fā)現(xiàn)在T2DM患者體內(nèi)，膠原組織中骨膠原代謝增高，導(dǎo)致骨吸收增強，血P水平較正常人群升高。在本研究中，DKK1基因表達(dá)水平在T2DM組升高，而β-catenin基因表達(dá)水平在T2DM組降低，同時P在T2DM組中表達(dá)升高，且股骨骨密度降低，P與β-catenin基因表達(dá)(r=-0.287；P=0.043)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示絕經(jīng)后女性T2DM患者體內(nèi)，血P水平隨β-catenin基因表達(dá)水平降低而增高，可進(jìn)一步說明絕經(jīng)后女性T2DM患者Wnt信號通路表達(dá)異常，DKK1基因的高表達(dá)可能抑制了其下游通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致β-catenin基因的低表達(dá)，進(jìn)而通過對血P水平的影響參與骨代謝異常。該研究結(jié)果為絕經(jīng)后女性T2DM患者骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制提供線索，并且為該人群骨質(zhì)疏松的預(yù)防及治療提供依據(jù)。