Glu-mGluR2/3-ERK信號通路在糖尿病并發抑郁癥大鼠前額葉皮質神經元凋亡中的作用

柳 卓，趙洪慶，孟 盼，楊 蕙，向 韻，王宇紅,

(1. 湖南中醫藥大學中藥粉體與創新藥物國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208；2. 湖南中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室，湖南 長沙 410007)

糖尿病并發抑郁癥(diabetic depression, DD)繼發于糖尿病，具有高發病率和高危害性的特點，其發病率占糖尿病患者的30%-50%，自殺風險是普通人群的8倍[1]。因而，開展DD的發病機制研究具有重要意義。前額葉皮質是大腦邊緣系統的關鍵區域，主要負責感覺認知、執行功能、情緒調節等，研究表明，抑郁癥的發生發展與大腦前額葉皮質損傷關系密切[2]。目前，對DD發生機制的研究幾乎都集中于海馬區，尚未涉及同樣負責調控認知及情緒的前額葉皮質區。越來越多的證據表明，谷氨酸(glutamate, Glu)在抑郁癥的發生過程中扮演了重要角色，其通過與代謝型谷氨酸受體2/3(metabotropic glutamate receptor 2/3, mGluR2/3)結合，激活下游細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)，進而通過下調神經營養因子合成、誘導神經元凋亡等方式，導致抑郁行為的產生[3-5]。然而，谷氨酸能否通過該途徑介導DD前額葉皮質的損傷，尚未見相關研究。因此，本研究以Glu-mGluR2/3-ERK通路為切入點，探討其在前額葉皮質神經元凋亡中的作用，對深入闡明DD的發病機制具有重要研究價值。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級SD大鼠，♂，體質量(180～220) g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號為SCXK(湘)2013-0004。動物購入后，飼養于溫度(25±2)℃、相對濕度(50±5)%、光/暗周期12 h/12 h的SPF級環境中，適應性喂養5 d。

1.2試劑與儀器Glu對照品(中國食品藥品檢定研究院)；LY341495(美國Sigma)；mGlu2/3、ERK、GFAP單克隆抗體(英國Abcam)；二抗試劑盒、DAB試劑盒、進口羊血清工作液(北京中杉金橋)。Morris水迷宮、開野視頻跟蹤系統(西班牙Panlab)；倒置顯微鏡(日本Olympus)；高效液相色譜儀(美國安捷倫)；組織切片機(美國Themo)。

1.3動物分組與造模50只SD大鼠分為2部分，其中20只隨機分為正常對照組和抑郁模型組，另外30只用于制備糖尿病模型。糖尿病模型建立方法為：高脂灌胃14 d后，大鼠一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)38 mg·kg-1，并于STZ注射72 h后測定大鼠空腹血糖值。去除造模過程中的死亡大鼠，選取空腹血糖≥16.70 mmol·L-1的大鼠，并依據血糖值隨機分為糖尿病模型組和DD模型組，每組11只。此后，正常對照組和糖尿病模型組大鼠正常飼養，抑郁模型組和DD模型組大鼠則繼續給予21 d慢性不可預見性溫和應激，應激方法包括4℃冰水浴、45℃熱水浴、電擊、夾尾、晝夜顛倒、傾籠等，每天隨機給予1次應激，同種應激不連續出現，造模期間大鼠均孤籠飼養。造模結束后，所有大鼠進行行為學測試，測試完成后，麻醉大鼠，每組一半大鼠剝離前額葉皮質于液氮中速凍，另一半經多聚甲醛灌注后取腦組織保存于甲醛溶液中固定。

在上述實驗中發現，DD模型組大鼠前額葉皮質區caspase-3表達明顯下降，神經元凋亡明顯，同時mGluR2/3、ERK表達也有異常。為確定該作用是否與調控Glu-mGluR2/3-ERK信號通路有關，重新選取35只SD大鼠，分為正常對照組、DD模型組，LY341495干預組(mGluR2/3阻斷劑組)，其中DD模型組和LY341495干預組造模方法同上，同時，LY341495干預組從應激造模d 1起連續腹腔注射LY341495(1 mg·kg-1) 21 d。

1.4行為學檢測

1.4.1曠場實驗 將大鼠放入底面劃分為25個小格的黑色敞箱中，每次從同一角落放入，大鼠適應1 min后，記錄4 min內的水平運動次數(四爪均在格內)和垂直站立次數(兩前爪抬起)。

1.4.2Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮實驗包括定位航行實驗和空間探索實驗，分別考察動物的學習和記憶能力，① 定位航行實驗：于應激d 17開始進行訓練，將大鼠面向池壁放入水中，自由尋找平臺(高出水面2 cm)，若60 s內未找到，則牽引其至平臺停留10 s，持續訓練4 d。訓練完成后，將大鼠從背對平臺方向放入水中，記錄大鼠爬上平臺所用時間，即為大鼠的逃避潛伏期時間(latency time)；② 空間探索實驗：于應激d 21撤去平臺，記錄大鼠60 s內在原平臺所在象限停留時間，即為大鼠的目標象限記憶時間(memory time)。

1.5HE染色取固定于甲醛溶液中的腦組織，常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋， 以5 μm厚連續切片。浸泡在0.01 mol·L-1PBS緩沖液中12 h，經蘇木精-伊紅染色后脫水，并用中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察、拍照，分析各組大鼠前額葉皮質區損傷情況。

1.6HPLC法檢測谷氨酸含量取冷凍保存的前額葉皮質，稱重，加入一定量甲醇后勻漿，離心后取上清液，0.22 μm濾膜過濾后待測。HPLC檢測條件為：色譜柱：氨基酸分析柱(250 mm×4 mm，5 μm)；流動相：含5%甲醇乙酸鈉-乙腈(80 ∶ 20)；流速：0.2 mL·min-1；進樣量：20 μL；柱溫：40℃。標準曲線的制備方法為：配成1 g·L-1的谷氨酸儲備液，依次稀釋成3.13、0.781、0.195、0.048 8、0.012 2 mg·L-1，根據各峰面積計算標準曲線為y=75.09x+34.63，相關系數為0.997 8，相關性良好。

1.7免疫組化法檢測相關蛋白表達取固定于甲醛溶液中的腦組織，常規石蠟包埋后切片，分別用75%、95%、100%梯度乙醇脫水，浸蠟，水化，沖洗，滴加山羊血清封閉液，37℃孵育30 min，去除血清，加caspase-3、mGluR2/3、ERK一抗4℃孵育過夜；PBS洗3次，滴加二抗試劑盒，反應增強液孵10 min，二抗孵10 min；沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，封片。將免疫組化切片在高倍鏡下(×400)進行拍攝，并采用Image-Pro Plus軟件分析積分光密度值(integral optical density, IOD)。

2 結果

2.1行為學檢測

2.1.1Morris水迷宮測試結果 Tab 1結果顯示，與對照組比較，各模型組大鼠潛伏期時間均有不同程度的延長，目標象限記憶時間縮短(P<0.05或P<0.01)，學習記憶功能均受到損害；與糖尿病組比較，抑郁癥和DD組大鼠學習記憶能力也有明顯的下降(P<0.05或P<0.01)。

Tab 1 Comparison of learning and

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsdiabetes model

2.1.2曠場實驗結果 Tab 2結果顯示，與對照組比較，各模型組大鼠水平和垂直運動次數均明顯下降(P<0.05或P<0.01)；與糖尿病組比較，抑郁組和DD組大鼠自主活動次數明顯下降(P<0.05或P<0.01)；與抑郁組比較，DD模型組大鼠自主活動能力也明顯下降(P<0.05)。

Fig 1 Results of HE staining in rat prefrontal cortex(×400)

Tab 2 Comparison of autonomous

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsdiabetes model;△P<0.05vsdepression model

2.2HE染色結果如Fig 1所示，正常大鼠前額葉皮質神經元形態規則，排列整齊，染色質均勻，神經元間隙正常；各模型組大鼠前額葉皮層神經元有不同程度的胞體腫脹，核固縮，胞質濃縮深染，排列紊亂，間隙增寬等病理現象，以DD組最為嚴重。

2.3大鼠前額葉皮層谷氨酸含量如Fig 2所示，與對照組比較，糖尿病組大鼠前額葉皮質谷氨酸含量無明顯變化，抑郁癥組和DD組有明顯升高(P<0.01或P<0.05)；與糖尿病模型組比較，抑郁癥組和DD組大鼠谷氨酸含量明顯升高(P<0.05)；與抑郁癥組比較，DD組大鼠谷氨酸含量明顯升高(P<0.05)。

Fig 2 Glutamate content in rat prefrontal

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsdiabetes model;#P<0.05vsdepression model

2.4Caspase-3免疫組化結果如Fig 3所示，與對照組比較，各模型組大鼠前額葉皮質區caspase-3免疫陽性均明顯增強(P<0.01或P<0.05)，其中以DD組陽性表達最為明顯，且與糖尿病組和抑郁癥組比較差異均有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。

2.5mGluR2/3和ERK的免疫組化結果如Fig 4所示，與對照組比較，各模型組大鼠前額葉皮質區mGluR2/3表達明顯上升，ERK明顯下降，以DD組趨勢最為明顯；與糖尿病組或抑郁癥組比較，DD組大鼠前額葉皮質區mGluR2/3和ERK表達差異也有顯著性(P<0.01或P<0.05)。

2.6mGluR2/3阻斷劑對前額葉皮質神經元凋亡的影響如Fig 5所示，給予mGluR2/3阻斷劑LY341495后，DD大鼠前額葉皮質神經元排列基本整齊、間隙正常，病理損傷情況得到一定緩解，caspase-3免疫陽性表達明顯下降(P<0.01)，但較正常對照組表達仍有一定增加(P<0.05)；谷氨酸含量較DD組有一定程度的上升(P<0.05)，可能是由于谷氨酸受體表達受抑制而致使谷氨酸堆積，mGluR2/3表達明顯下降(P<0.01)，ERK表達上升(P<0.05)。說明mGluR2/3-ERK信號在前額葉皮質神經元凋亡過程中確實起到調控作用。

3 討論

抑郁癥是糖尿病常見的并發癥之一，我國約有51%的糖尿病患者存在不同程度的抑郁癥。糖尿病可與抑郁癥相互加重，增加患者的病死率和致殘率，DD患者自殺率高達10%[5]。前額葉皮質與感覺認知、情緒調節密切相關[6]，糖尿病患者容易出現認知功能下降，主要表現為前額葉皮質功能受損[7]。前額葉皮質神經元功能的缺失及神經膠質性增生則會導致抑郁癥的發生[8]。

Morris水迷宮被廣泛用于研究與空間學習記憶相關的腦區功能評價，曠場實驗是通過觀察大鼠的自發性探索活性評價大鼠的活動能力，兩者均是動物抑郁樣行為評價的重要方法。本實驗發現，DD大鼠學習記憶功能明顯下降，自主活動能力降低，較糖尿病組和抑郁組均更為嚴重。Caspase-3是細胞凋亡執行階段的關鍵蛋白，負責對部分或全部關鍵蛋白進行酶切，使DNA片段化，進而導致細胞凋亡[9]。本研究中，DD大鼠前額葉皮質區神經元缺失明顯，并伴有胞體腫脹、核固縮、空泡變性等病理現象，同時caspase-3陽性表達明顯增多，表明DD大鼠前額葉皮質神經元病理改變與凋亡有關。

Fig3Caspase-3immunohistochemicalstaining
inprefrontalcortexofrats(×400)

Fig4mGluR2/3andERKimmunohistochemicalstaininginprefrontalcortexofrats(×400)

Fig 5 Effects of mGluR2/3 blocker (LY341495) on apoptosis of prefrontal cortical neurons(×400)

谷氨酸是一種興奮性神經遞質，對中樞神經系統正常功能活動與神經調節發揮著重要作用，但高濃度谷氨酸具有神經毒性作用，能損害神經元而誘發神經精神性疾病[10]。糖尿病狀態下，谷氨酸含量異常升高，與胞內mGluR2/3過度結合，繼而激活下游ERK信號，活化的ERK進入細胞核內，一方面磷酸化轉錄因子，從而調控基因的表達，影響細胞周期，進而介導細胞凋亡的過程[11]；另一方面，通過調控相關信號，促使神經營養因子合成及分泌下降，神經元營養缺失而逐漸凋亡[12]。本實驗結果表明，DD大鼠前額葉皮質區谷氨酸含量明顯升高，mGluR2/3免疫陽性增強，ERK免疫陽性明顯減弱，說明Glu-mGluR2/3-ERK通路可能在介導前額葉皮質神經元凋亡過程中發揮了重要作用。

LY341495是mGluR2/3的特異性拮抗劑[13]。本實驗通過使用LY341495進一步證實Glu-mGluR2/3-ERK通路在DD前額葉皮質神經元凋亡中的關鍵作用，結果表明，給予LY341495后，DD大鼠谷氨酸含量升高，mGluR2/3陽性表達下降，說明阻斷劑發揮作用，mGluR2/3表達受阻，而谷氨酸由于其受體表達抑制而致其在腦區堆積，ERK陽性表達較模型組有明顯變化，說明其受到上游mGluR2/3表達的影響。同時，DD大鼠前額葉皮質損傷情況得到一定程度的緩解，凋亡執行蛋白caspase-3免疫陽性表達明顯下降，說明LY341495能使DD大鼠前額葉皮質神經元凋亡減少，并改善其病理損傷。上述結果說明，DD疾病下，Glu-mGluR2/3-ERK信號通路調控caspase-3表達，介導前額葉皮質區神經元凋亡，而mGluR2/3阻斷劑能逆轉這一過程。

綜上，我們認為前額葉皮質谷氨酸含量異常增加，Glu-mGluR2/3-ERK信號障礙，導致caspase-3表達上升，神經元發生凋亡，是導致DD發生的重要原因。本研究對于以前額葉皮質為靶區的DD發病機制研究具有重要意義，下一步將繼續研究DD下大腦前額葉皮質Glu-mGluR2/3-ERK通路與神經血管單元損傷間的關系。

(致謝: 本實驗主要在湖南中醫藥大學中藥粉體與創新藥物國家重點實驗室培育基地完成，在此對實驗室各位老師及同學的幫助表示衷心的感謝!)