D-手性肌醇對db/db小鼠降血糖和肝臟保護作用及機制

范春雪，魏 敏，張丹丹，高慶瑤，黃菡雪，王建行，韓淑英

(華北理工大學1. 藥學院、2. 臨床醫學院、3. 冀唐學院、4. 基礎醫學院、5. 河北省慢性疾病重點實驗室，唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室，河北 唐山 063000)

2型糖尿病的發展會導致多種并發癥，肝損傷是其中之一[1-2]。肝臟與糖脂代謝密切相關[3]，探究保護糖尿病肝損傷的作用機制，對于糖尿病的治療和預后都很重要。

D-手性肌醇(D-chiro-inositol，DCI)是羥基環己醇的一種手性結構，具有促進肝臟脂代謝、胰島素增敏、降血糖、抗氧化等作用[4]，有希望應用于2型糖尿病的臨床治療[5]。目前，已有文獻對DCI降低血糖的機制進行初步探究，表明DCI通過作用于PI3K/Akt信號通路，降低Ⅱ型糖尿病大鼠的血糖[6]。另有研究表明，DCI可以通過抑制肝糖輸出(hepatic glucose output， HGO)，在體內發揮抗糖尿病作用[7]。但國內外還未見有關DCI對糖尿病肝臟保護作用機制的研究報道。本實驗通過給予db/db小鼠不同劑量DCI，觀察DCI的降糖作用及其對肝損傷的抑制作用，并探討可能機制，為DCI進一步研發和應用提供實驗依據。

1 材料

1.1實驗動物35只10周齡♀SPF級db/db小鼠(體質量39～48 g)，10只同源同周齡♀ db/m小鼠(體質量17～20 g)，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(蘇)2016-0010，飼養于華北理工大學動物實驗中心SPF級實驗室。60Co輻射小鼠顆粒飼料(南京貝斯弗飼料有限公司，生產批號：20171050001MF01)。

1.2藥物與試劑DCI(Sigma公司，Lot：#BCBQ3950V，貨號：101678071，白色結晶，純度99%)；天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸轉氨酶(alanine amino-transferase,ALT)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號C010-2、C009-2)；葡萄糖轉運蛋白4 (glucose transporters 4，GLUT4)抗體(武漢博士德公司，貨號：BM2162)；胰島素受體底物2(insulin receptor substrate 2，IRS2)抗體[EPR904(2)](Abcam公司，貨號：ab134101)；胰島素受體(insulin receptor，IR)抗體(Gene Tex公司，貨號：GTX101136)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京雷根生物技術有限公司，貨號：PT0001)；Masson染色試劑(索萊寶科技有限公司，批號：20160913)。

1.3儀器羅氏血糖儀及配套血糖試紙(德國羅氏診斷有限公司)；200PRO酶標儀(瑞士Tecan公司)；Universal Hood Ⅲ凝膠成像分析系統(美國伯樂)；5180R高速低溫離心機(Eppendorf公司)；HMIAS-2000真彩病理圖像分析系統(高騰科技有限公司)；BX5光學顯微鏡(日本Olympus公司)；RM2245輪轉式切片機(Leica公司)；H-7650透射電鏡(日本日立公司)。

2 方法

2.1小鼠分組與給藥將小鼠適應性飼養1周，測定隨機血糖值，連續2次血糖均值>16.1 mmol·L-1的納入實驗，選取符合要求的30只小鼠(剔除血糖和體質量差異較大的小鼠)，隨機分為模型對照組(MCG)、高劑量DCI組(HDCI)和低劑量DCI組(LDCI)；db/m為正常對照組(NCG)。每組10只。HDCI與LDCI給藥量分別70、35 mg·kg-1·d-1，MCG與NCG給予同體積純水。于每日上午9時按照體質量分別灌胃，持續6周。

2.2觀察指標

2.2.1一般表征觀察 給藥期間密切觀察小鼠的精神狀態、活動、毛色及大小便等有無改變。每周測定小鼠的飲水量、進食量和體質量變化。

2.2.2血糖測定 首次給藥血糖動態觀察：用血糖儀測定第1次給藥前及給藥后禁食0、1、2、4 h的血糖。隨機血糖測定：于給藥0周、2周、4周、6周，測定db/db小鼠隨機血糖(給藥后2 h)。

2.2.3血清AST、ALT和肝重指數測定 末次給藥后，禁食14 h，吸入性七氟烷麻醉(將小鼠口鼻對準含七氟烷瓶口約5～6 s)小鼠，迅速摘眼球取血于1.5 mL EP管中，分離血清。微板法測定血清中AST和ALT的水平。小鼠取血后，立即剖腹取肝臟，于生理鹽水中漂洗，用濾紙吸去表面液體，稱重。計算肝重指數(liver weight index，LI)，LI/%=肝重/體重×100%。

2.2.4肝臟病理形態觀察 肝臟稱重后，于小鼠肝臟右葉切取1 mm3組織塊，用體積分數為0.025戊二醛溶液固定12 h，磷酸緩沖液沖洗8 h，體積分數為0.01鋨酸中浸泡2 h，沖洗脫水后使用Epon812包埋，切片(70 nm)，使用枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察、拍照。

切取適宜大小肝臟右葉于體積分數為0.04多聚甲醛中固定72 h，修塊置于包埋盒中，純水沖洗8 h，常規石蠟包埋處理(軟、硬蠟比例為1 ∶3)，4 μm厚切片。于65℃烤片2 h，進行常規HE染色；按照說明書步驟進行Masson染色。光鏡下觀察db/db小鼠肝臟形態結構變化。

2.2.5免疫組織化學法測定肝組織GLUT4蛋白的表達 將肝臟組織石蠟切片脫蠟水化，EDTA高壓加熱煮沸修復抗原，PBS洗凈，封閉血清，一抗GLUT4以1 ∶200稀釋覆蓋組織切片，置于冰箱中4℃過夜，PBS沖洗后滴加二抗，置于37℃恒溫箱中孵育，沖洗后，DAB試劑顯色50 s，蘇木精復染細胞核1 min。改用PBS代替一抗，其他實驗條件相同進行上述實驗設為陰性對照組。光鏡下可見陽性信號呈棕黃色，觀察GLUT4蛋白表達及分布，并應用Image-Pro Plus 6.0軟件測定平均積分吸光度。

2.2.6Western blot檢測IR和IRS-2蛋白表達 冰上切取凍存肝臟組織約30 mg，加300 μL RIPA裂解液，低溫高速勻漿3次，冰上裂解2 h，4℃離心吸取上清2次，BCA蛋白定量，調整蛋白濃度為5 g·L-1。樣品中加入5×loading buffer，沸水浴變性，上樣量20 μL。配制12%分離膠用于IRS2(137 ku)的檢測，配制8%分離膠用于IR(30 ku)的檢測，配制5%濃縮膠。電泳、轉膜后，5%脫脂奶粉封閉；加入一抗(IR 1 ∶1 000，IRS-2 1 ∶1 000)4℃搖床過夜，TBST洗滌3次；加入二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次；吸取顯影液(1 ∶1)200 μL均勻涂在膜上，置于自動顯影儀中顯影。應用Image J軟件測定IR、IRS-2與β-actin顯影條帶的灰度值，內參為β-actin。

3 結果

3.1DCI對db/db小鼠一般表征的影響NCG組小鼠精神狀態良好、活潑好動、反應敏捷、毛發光亮；MCG組小鼠精神萎靡、動作遲緩、毛發稀疏無光澤、多飲、多食、多尿；高、低劑量DCI干預組小鼠上訴一般表征有不同程度的改善，HDCI改善更明顯。

3.2DCI對db/db小鼠血糖的影響

3.2.1DCI首次給藥對db/db小鼠血糖的影響 首次給予DCI后禁食，觀察小鼠血糖動態變化見Tab 1，NCG組禁食4 h血糖無明顯變化，MCG、HDCI、LDCI組各點血糖值明顯高于NCG組(P<0.01)；與MCG組相比，高、低劑量DCI給藥后各時間點血糖值均有不同程度降低，LDCI組與MCG組相比無明顯差異(P>0.05)，HDCI組血糖下降明顯(P<0.01)；高、低劑量給藥組進行比較，給藥后1、2、4 h存在明顯差異(P<0.01)，高劑量DCI組血糖值下降更明顯。

3.2.2DCI對db/db小鼠隨機血糖影響的動態觀察 DCI對db/db小鼠隨機血糖的動態變化見Tab 2，給藥6周內NCG組隨機血糖無變化，MCG組隨機血糖明顯高于NCG組(P<0.01)，且第6周最高；與MCG組相比，LDCI組和HDCI組隨機血糖不同程度地下降(P<0.01)，其中給藥第4 周降低幅度最大。HDCI組隨機血糖值與LDCI組比較沒有明顯差異(P>0.05)。

Tab 1 Effects of DCI on blood glucose for first time in db/db

**P<0.01vsNCG;##P<0.01vsMCG;△△P<0.01vsHDCI

Tab 2 Effects of DCI on random blood glucose in db/db

**P<0.01vsNCG;##P<0.01vsMCG

3.2.3DCI對db/db小鼠血清AST、ALT和肝重指數的影響 Tab 3結果顯示，MCG組小鼠血清AST活性高于NCG組(P<0.05)；高、低劑量DCI對血清AST有不同程度降低作用，但與NCG、MCG組相比，均無統計學差異(P>0.05)。各組db/db小鼠血清ALT活性明顯較db/m小鼠升高(P<0.01)；HDCI與LDCI組血清ALT值有降低趨勢，但與MCG組比較差異無顯著性(P>0.05)。各組db/db小鼠LI值明顯高于db/m小鼠(P<0.01)，LDCI和HDCI組LI值較MCG組略有升高(P>0.05)。

Tab 3 Effects of DCI on serum AST and ALT levels

*P<0.05,**P<0.01vsNCG

3.3DCI對db/db小鼠肝臟形態結構的影響Fig 1A的HE染色結果顯示，各組小鼠肝組織細胞核被染成藍色，肝細胞質被染成粉紅色。NCG組小鼠肝細胞形態結構正常，胞質染色均勻，未出現水腫，肝小葉清晰，未出現脂肪變性；MCG組小鼠肝細胞條索狀排列基本消失，肝細胞明顯腫脹變形，有部分肝細胞發生溶解性壞死，可見有炎細胞大量聚集，肝血竇狹窄或閉鎖，大量肝細胞脂肪變性，形成脂滴空泡；與MCG組相比，HDCI組、LDCI組小鼠肝臟的病理變化明顯減輕，肝細胞基本呈條索狀排列，脂滴空泡有所減少。HDCI組小鼠肝組織損傷減輕更明顯。

Fig 1B的Masson染色結果顯示，NCG組小鼠肝組織只在門靜脈處見少許藍染物質，MCG組則出現明顯的藍色膠原纖維，主要分布在血管、匯管區及Disse間隙；LDCI組與HDCI組藍染膠原纖維較MCG組明顯減少。

Fig 1C的透射電鏡結果顯示，NCG組小鼠肝細胞質中內質網、高爾基體等細胞器形態正常，結構清晰，線粒體豐富；MCG組小鼠肝細胞內質網斷裂，線粒體減少、變形，正常結構幾乎消失，可見散在脂滴和大量膠原纖維；HDCI組和LDCI組較MCG組肝細胞器形態結構明顯改善，少見膠原纖維。

3.4DCI對db/db小鼠肝臟組織中GLUT4、IR和IRS2蛋白表達的影響

3.4.1免疫組化法檢測GLUT4蛋白表達 如Fig 2所示，NCG組小鼠肝臟組織細胞質和細胞膜上出現大量的棕黃色染色，且分布均勻，為高表達，細胞核內未見陽性表達。MCG組小鼠肝臟細胞中GLUT4蛋白表達程度偏低，可見少許棕黃色顆粒分布。HDCI組與LDCI組GLUT4的表達明顯高于MCG組，棕黃色陽性染色大面積分布，且表達均勻，但HDCI組染色切片總體顏色要深于LDCI組。計算GLUT4陽性表達百分比結果表明，MCG組GLUT4的蛋白表達明顯低于NCG組(P<0.01)；HDCI組的GLUT4表達明顯高于MCG組(P<0.01)；HDCI組的表達最高，與NCG組結果相近(P>0.05)；HDCI組明顯高于LDCI組(P<0.01)。

3.4.2Western blot法檢測IR、IRS2蛋白表達 如Fig 3所示，MCG組IR表達明顯低于NCG組(P<0.01)；高劑量DCI組IR蛋白表達水平明顯高于模型組、NCG組和LDCI組(P<0.01)；低劑量DCI組與MCG組比較結果相近(P>0.05)。MCG組IRS2蛋白表達低于NCG組(P<0.01)；高劑量DCI組表達水平與MCG組比較明顯升高(P<0.01)，與NCG組表達結果相近(P>0.05)；低劑量DCI組IRS2的表達水平高于MCG組和NCG組(P<0.01)，與HDCI組表達結果無差異(P>0.05)。

Fig 2 Immunohistochemistry of GLUT4 protein expression in hepatic tissues of db/db

4 討論

2型糖尿病嚴重危害人類健康，該病可致多種器官的損傷，尤以肝損傷更為明顯，長期高血糖能發展成為各種肝臟的并發癥[8]。db/db小鼠是國際公認的自發2型糖尿病動物模型，具有典型的高血糖、肥胖和肝、腎等器官損傷的特點[9]，該小鼠瘦素受體基因自然突變而缺陷，4周齡開始出現血糖升高和肥胖，早期肝就可出現脂肪性病變，隨著時間推移肝臟逐漸向纖維化、肝硬化發展[10]。

Fig 3 Western blot of IR and IRS2 in hepatic

*P<0.05, **P<0.01 vs NCG; #P<0.05, ##P<0.01 vs MCG; △P<0.05, △△P<0.01 vs HDCI

本文應用db/db小鼠動物模型，觀察了DCI口服給藥對db/db小鼠血糖和肝損傷的影響，并探討其可能機制。結果表明，DCI首次給藥1 h就能明顯降低db/db小鼠血糖，連續給藥6周能持續降低隨機血糖，高劑量DCI降血糖作用更明顯。說明DCI降糖作用起效較快、持續時間長，進一步證明了DCI有較好的降低血糖作用。通過觀察血清AST、ALT、肝重指數及肝臟組織形態結構的變化，考察DCI對糖尿病肝損傷的影響情況。結果顯示，DCI對db/db小鼠血清AST和ALT有一定的降低作用，但無統計學差異，是由于實驗后期模型組小鼠肝損傷已經非常嚴重，大部分肝細胞已經發生脂肪變性壞死，產生AST和ALT明顯減少，所以給藥組與模型組比較無明顯差異；肝重指數給藥組略高于模型對照組(無統計學差異)，是由于模型組體質量較高，所以肝重指數有一定程度升高，但DCI是否有一定的抑制脂肪生成作用，有待深入研究。從光鏡和電鏡觀察可見，DCI可減輕肝組織的脂肪變性、纖維化程度、炎癥細胞浸潤及細胞內線粒體和內質網等細胞器的損傷，緩解了db/db小鼠肝臟損傷的進展程度。應用免疫印跡和免疫組化法進一步探究了DCI的作用機制，通過測定肝組織IR、IRS2、GLUT4的蛋白表達發現，DCI可不同程度上調IR、IRS2和GLUT4蛋白的表達，HDCI組表達上調更明顯。說明DCI是通過影響IR、IRS2及GLUT4的表達，在胰島素信號轉導通路中發揮積極作用，從而有效緩解胰島素抵抗，降低血糖。

IR是與胰島素結合的靶蛋白，大量存在于肝臟細胞膜上，激活后促使IRS磷酸化，從而進行下一步的信號轉導。研究表明，IR表達的下調會使人體內胰島素抵抗，IR的過量表達會對糖尿病患者造成低血糖的風險[11]。IRS2是IR下端信號因子，IRS2在促進肝臟糖原合成，以及抑制HGO中具有重要作用[12]。GLUT4是細胞中胰島素信號轉導末端因子，其主要作用為促使胞外葡萄糖的跨膜轉運[13]。

DCI在胰島素轉導通路中發揮重要作用。張澤生等[4,14]報道，人體內缺乏DCI會導致胰島素抵抗，DCI能有效增加胰島素抵抗HepG2細胞的葡萄糖消耗量，促進2型糖尿病大鼠糖原的合成，改善胰島素抵抗。本研究結果也證明了DCI的降糖作用，但從IR、IRS2和GLUT4蛋白表達的角度探究DCI的作用機制，目前未見文獻報道。有文獻報道，DCI有抗氧化、降低肝臟脂質含量，并能緩解酒精性脂肪肝的作用[15]。本研究首次從胰島素轉導通路為基礎，探究DCI對糖尿病肝損傷的保護作用和作用機制，表明DCI對糖尿病肝損傷有明顯的抑制作用。

綜上所述，DCI具有降低db/db小鼠血糖，抑制胰島素抵抗，減輕肝臟組織的脂肪變性和抑制肝臟纖維化的作用。推斷可能是由于DCI提高了小鼠肝臟組織中的IR、IRS2和GLUT4蛋白的表達，促進葡萄糖的攝取利用，緩解了胰島素抵抗，降低血糖，從而產生保護肝臟的作用。但DCI的作用機制可能是多靶點多途徑，還需要進一步的研究。