ICP-OES酶標儀法與國標法測定土壤全磷的比較

張麗萍 許麗衛 王久榮* 袁紅朝 賀珍

摘? 要：為了提高土壤樣品全磷含量的檢測效率，研究了電感耦合等離子體發射光譜儀（inductively coupled plasma-optical emission spectrometer，ICP-OES）、多功能酶標儀在土壤全磷含量檢測的應用，并與國標法的測定結果進行了比較。結果表明，利用ICP-OES、多功能酶標儀測定土壤全磷結果可信，檢測線性范圍為0～100 mg/L、0～2 mg/L，r2>0.995，較國標法的0～1mg/L拓寬了檢測范圍;檢出限為0.000015mg/L、0.0085mg/L，回收率介于95%～108%，這2種方法的測定結果與國標方法無顯著性差異。本文為土壤全磷的檢測提供了2種快速、高效的檢測方法，對快速測試大量土壤樣品的全磷含量，及時指導農業生產具有現實意義。

關鍵詞：電感耦合等離子體發射光譜儀（ICP-OES）;多功能酶標儀;紫外可見光分光光度計;土壤全磷

中圖分類號：X142? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.11974/nyyjs.20181032006

磷元素（P）是植物生長發育的必需營養元素，它以多種方式參與土壤系統內的各種代謝過程，為不可再生的礦質資源，是評價土壤質量的重要指標之一 [1-3]。傳統國標方法采用鉬銻抗紫外可見分光光度計法檢測，存在樣品pH、溫度、顯色時間、儀器無自動進樣器等因素影響，對分析大量樣品操作較復雜，耗時且工作量大[4-5]。隨科學技術的發展，檢測儀器日漸豐富，拓寬了磷素的測定技術[6-9]。本文依據磷素測定原理和儀器硬件原理，研究了ICP-OES、多功能酶標儀、測定隨機選取不同地區土壤的全磷含量，比較了三者準確度、回收率、精密度和重復性，旨在為實驗室日漸豐富的儀器拓寬檢測項目提供技術性支持，增加磷元素含量檢測手段，加快分析速度，減少試劑的使用，保護環境。

1? ? ?材料與方法

1.1? ? ?試驗材料及主要試劑

供試土壤樣品1-2號采自湖南桃源;3-4號采自廣西環江;5-7號采自湖南洞庭湖濕地;8-37號采自湖南長沙近郊金井，樣品經風干后過60目篩待用。供試儀器為紫外可見光分光光度計（Lambda 25，美國，PerkinElmer）、多功能酶標儀（Infinite M200 PRO，瑞士，TECAN）、電感耦合等離子體發射光譜儀（720 ICP-OES，美國，Agilent）。試驗主要試劑：去離子水，無水乙醇、98%濃硫酸、NaOH、KH2PO4、酒石酸銻鉀、鉬酸銨、抗壞血酸等，所有的試劑均為分析純。

1.2? ? ?磷素顯色原理和儀器測定原理

磷素顯色檢測原理：在酸性介質中，正磷酸鹽與鉬酸銨反應，在銻鹽存在下生成磷鉬雜多酸后，立即被抗壞血酸還原，生成藍色的絡合物，在一定波長下，比色測吸光度定量。

紫外可見光分光光度計與酶標儀測定原理：紫外可見分光光度計與酶標儀工作原理基本相同，在最大吸收波長處測量一定濃度樣品溶液吸光度，根據朗伯比爾定律算出樣品溶液的濃度。 酶標儀因取樣量少現被廣泛用于實驗室檢測。

ICP-OES測定原理：樣品經處理制成溶液后，經自動進樣器引入霧化器，經霧化室被載氣帶入溫度達6000～10000K的等離子體焰矩，試樣中組分被原子化、電離、激發，當這些激發態的粒子回到穩態時放出一定的能量（表現為一定波長的光譜）， 測定每種元素特有的譜線和強度，與標準溶液相比，就可對樣品進行定性與定量分析。

1.3? ? ?試驗方法

1.3.1? ? ?樣品的消解

土壤樣品按照國標方法（LY/T 1232-1999 森林土壤全磷的測定）消解，將所含磷素化合物全部氧化成正磷酸鹽， 轉移定容至50mL的容量瓶，混合均勻后，作為待測溶液。

1.3.2? ? ?紫外可見分光度計、酶標儀測定土壤全磷

吸取待測液5～50mL容量瓶，加入少量水，滴入2滴2，4二硝基酚后，用稀堿調pH至微黃，再加入5mL鉬銻抗顯色劑，室溫下（25℃）放置 30h顯色后，每份顯色樣品另取200uL至96孔酶標板;標準系列按50mL容量瓶中先分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL濃度為50mg/L的PO43--P標準溶液，各加5mL鉬銻抗顯色劑，去離子水定容，配制成濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ppm的標準溶液。在882nm 波長下，紫外-可見分光度計、酶標儀按照1.2中測定原理分別比色測吸光度定量。

1.3.3? ? ?ICP-OES測定土壤全磷

用去離子水稀釋待測液10倍（0.5mL 待測液加4.5mL去離子水）直接上機進行測試。標準樣品系列按50mL容量瓶中先分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和10 mL濃度為50 mg/L的PO43--P標準溶液，再加入與樣品同等背景離子強度的對照溶液，后用去離子水定容。按照1.2 中ICP的測定原理，選擇波長（214.914nm，178.222nm）下測定其響應值。

1.3.4? ? ?紫外-可見分光度計、酶標儀和ICP-OES測定土壤全磷的方法驗證

1-7號樣品的消解液，分別用標準加入法做回收率測定;用標準土樣GBW07403、GBW07404、GBW07454、GBW07457同時處理3份做重復性試驗，評價方法的準確度同一樣品待測液分別在3臺儀器上運行儀器上連續運行7次，評價方法的精密度。

2? ? ?結果與分析

2.1? ? 紫外-可見光分光度計、酶標儀和ICP-OES標準曲線的制作及檢測范圍的確定

配制好用于土壤全磷測定的標準系列溶液后分別經3臺儀器運行后， PO43--P濃度與儀器響應值（吸光度或離子強度）呈良好的線性關系，結果見表1。

2.2? ?紫外-可見分光度計、酶標儀和ICP-OES儀分析結果比較

由下表2可以看出，土壤樣品經紫外-可見分光度計、酶標儀和ICP-OES分析儀檢測，標準物質測定值均落在可信范圍內（GBW07403其全磷含量為320±18mg/kg、GBW07404其全磷含量為695±28mg/kg、GBW07454其全磷含量為857±39mg/kg、GBW07457其全磷含量為493±27 mg/kg），3種儀器測定平均結果的相對偏差小于3%，按國標法方要求絕對偏差小于0.05%。結果表明，3臺儀器的測定結果無顯著差異。

2.3? ? ?準確度與精密度、回收率及檢出限的測定

在不同土壤及土壤含量存在低中高差異情況下，通過外添加0.1、0.35、0.60 mg/L（0.70 mg/L）磷濃度（n=3）進行回收率測定，結果見表4。結果表明， ICP-OES和酶標儀測定7個待測土壤樣品的平均回收率為95%～108%，與紫外-可見光分光度計測定結果無顯著性差異。選擇標準物質GBW07403、GBW07404、GBW07454、GBW07457，按照傳統前處理方法做3份重復（n=3）待測液，分別經過3臺儀器檢測做重復性，一份進行7次測定做精密度及檢測限，結果見表3。結果表明，ICP-OES和酶標儀測定4個標準土樣待測液中磷濃度的重復性和精密性良好，相對標準偏差分別小于3.58%和3.81%，略差于國標法，這可能是與硫酸基質有關;檢出限為0.000015～0.0085 mg/L，優于國標法。

2.4? ? ?實際樣品方法驗證

隨機采取長沙近郊30個土壤樣品，按照國標法前處理，經紫外-可見分光度計、酶標儀和ICP-OES分析儀檢測，經比較ICP-OES、酶標儀測定結果與紫外可見分光光度計測定結果無顯著差異，絕對偏差均<0.05%，結果見表5。

3? ? ?討論

3.1? ? ?氫氧化鈉熔融法測定土壤全磷的注意事項

由于不同地區土壤樣品的pH以及金屬元素含量存在差異，在采用氫氧化鈉熔融后，某些樣品按照標準方法加入7mL 1：3 硫酸轉移，定容后溶液中仍會存在大量絮狀物，這時要求續加硫酸，保證絮狀物完全溶解，如若轉移酸度不夠，存在絮狀物，會造成土壤全磷檢測結果偏低，如廣西環江部分堿土樣品就存在這個問題。在利用磷素顯色原理檢測時，由于轉移酸度不一致，需先對樣品逐一調整pH，再加入鉬銻抗顯色劑顯色檢測。若是同一批次土壤轉移酸度一致，有文獻報道可以將鉬銻抗顯色劑的酸度調整為4.5N硫酸[10];磷素的顯色反應受環境溫度及顯色時間相關性很大，冬天檢測時需控制環境溫度，提前開空調，或放入烘箱中保證顯色溫度達到25℃，可加快顯色;為避免系統誤差，標線制作與樣品的顯色pH、溫度、時間需保持一致。

在利用多功能酶標儀檢測樣品時，由于酶標板是微量測定，所以樣品與標樣的微小體積不一致，對結果都會影響比較大。樣品板本身有背景吸收，所以建議先做空白板的檢測，再加入樣品進行檢測;檢測為垂直檢測，酶標板加入待測液時盡量一個方向緩慢打入，減少晃動及液體掛壁，保持液體厚度與標準系列一致。多功能酶標儀要求測試體積小于250uL，使用該方法可以減少試劑的使用及廢液產出，有利于保護環境。

在利用感耦合等離子體質譜儀測定樣品時，由于土壤樣品經過氫氧化鈉熔融，硫酸溶液轉移，直接上機存在鹽濃度大，硫酸密度大易積存矩管，基底背景干擾大，引起火焰抖動，因而需要將待測液稀釋10倍后上機，由于存在鈉離子的干擾且稀釋后磷素濃度變低，因而儀器需重新延長積分時間從1s延長至3s，且配置的標準系列需要添加與檢測樣品一致背景的試劑空白。這也是影響ICP-OES測定土壤全磷精密度的主要原因，如若用濕法消解，RSD可以得到極大改善。

3.2? ? ?3種儀器各自優勢

紫外可見分光光度計是標準方法要求的測定儀器，使用該方法工作量大，但精密度、重復性、準確度良好;酶標儀由于樣品厚度容易變化，其精度沒有紫外可見分光光度計高，需要多做平行，取平均值;但其少于2min就可以將一塊96孔酶標板上的所有樣品檢測完，效率更高，而測定的待測液少于250uL，更加節約試劑，產出廢液更少，更保護環境。ICP-OES分析儀在樣品熔融轉移后，稀釋10倍可以直接上機檢測，減少了顯色反應這一步驟，儀器帶有自動進樣器，大大減少了工作量，且可以同時檢測其他元素，如鉀等，該方法可以用于大量樣品快速測定。從數據結果看，其由于存在背景干擾及稀釋因素的影響，RSD較紫外可見分光光度計法大，但如若改變樣品前處理方式，如應用微波消解或硝酸高氯酸混酸濕法消煮等樣品前處理方式，這個問題就迎刃而解，且同時可以快速檢測更多元素，ICP-OES是現行大量元素測定的主要方式。

4? ? ? 結論

本文按照國標法對標準物質土樣及實際土壤樣品進行氫氧化鈉熔融前處理，經紫外可見分光光度計、多功能酶標儀、ICP-OES測定，結果表明：酶標儀、ICP-OES法測定土壤全磷的結果， 線性、精度、重復性、回收率、準確性良好，與國標法紫外可見分光光度計的測定結果基本能符合，無顯著性差異，其結果均能滿足全磷分析的準確度要求。因此，酶標儀、ICP-OES可以成為土壤全磷的分析檢測儀器，與傳統方法比較，這2種方法準確、簡便、快速。鑒于植物樣品硝酸高氯酸消解基質更簡單， 酶標儀、ICP-OES也可以測定植物樣品的全磷及其他元素。

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