幼犬腦組織Doublecortin的表達觀測

李明，武志兵，楊永強，王文成，侯燕紅，劉學敏

長治醫學院人體解剖學教研室，山西長治 046000

早期的神經科學研究認為，哺乳動物自出生后中樞神經系統的結構非常穩定，神經系統的發育已處于完成狀態，不存在神經發育和神經再生的現象[1]。然而隨著神經科學研究技術和手段的不斷更新進步，科學家在對3H-thymidine和BrdU的應用研究中發現哺乳動物在出生后在其腦組織的一些部位仍然存在著活躍的神經發育和神經再生現象，這些部位集中位于海馬、齒狀回、室管膜下區和腦皮層這些部位，在這些部位陸續發現了新生的未成熟的神經元[2]。DCX（doublecortin）是近些年來發現的一種與神經發育和神經元遷移有關的微管相關蛋白，在哺乳動物的胚胎腦神經發育和出生后神經發育過程中，該蛋白對于不成熟神經元的定向遷移具有重要的作用[3]，DCX的表達具有一定的特異性，表達于處于發育階段的未成熟神經元，尤其在處于遷移狀態的未成熟神經元表達明顯，但隨著未成熟神經細胞的不斷分化成熟，DCX的表達呈下調趨勢。所以DCX作為檢測未成熟神經元的重要標記物，在神經發育和神經再生的研究中具有較強的特異性研究價值[4]。該研究于2016年7—2017年4月選取出生后15 d幼犬4只作為研究對象，觀察了DCX在哺乳動物出生后早期腦組織的表達分布情況，旨在探討哺乳動物出生后早期神經發育的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物處理

選取出生后15 d的普通哺乳動物家犬4只為實驗對象，實驗動物由本院實驗動物中心提供。實驗動物中心懷孕母犬室溫飼養，分娩后的幼犬給予母乳加正常飲食15 d，選取健康幼犬4只，腹腔注射麻醉劑水合氯醛（0.4 mL/100 g）實施動物麻醉，動物麻醉好后迅速解剖開胸腔，左心室穿刺插管至升主動脈，開放點滴灌注生理鹽水1 000～1500 mL，后灌注4%的多聚甲醛700 mL，取腦后放置于多聚甲醛溶液固定2 d，將后固定好的犬腦在15%～30%的蔗糖溶液中梯度脫水。用包埋劑將脫水后的腦組織包埋后置于低溫冰箱保存8 h。把冷凍好的犬腦冠狀位冰凍切片，切片厚度為15 μm，將組織切片置于抗凍液中低溫冰箱保存待用。

1.2 免疫組織化學染色

主要實驗試劑儀器：DCX抗體（羊抗，ab113435，Sigma公司），生物素化二抗 （ab6785，Sigm公司），ABC 試劑（PK-4000，Vector公司），顯色劑 DAB（二氨基聯苯胺，Vector公司），無水乙醇和H2O2（154525,161874，湖南師范大學試劑廠），多聚甲醛和二甲苯（152346,165224，上海國藥集團），冰凍切片機（LEICA，德國），光學顯微鏡（Olymbus E53，日本）。

實驗方法：取出已保存的冰凍切片室溫下靜置1 h，選取帶有齒狀回切片3～5片，于PBS緩沖液中充分漂洗3次，10 min/次，后把切片放入含1%H2O2的PBS溶液中處理30 min，然后再次洗片3次。接著再將切片放入含有5%的馬血清PBS溶液中室溫孵育1 h；添加 DCX 抗體（羊抗，濃度 1：1 000）室溫 1 h，然后4℃冰箱過夜。第2日取出反應盒室溫靜置1～2 h，漂洗切片3次后，添加生物素化二抗（濃度1：400）室溫孵育2 h；切片充分漂洗3次后加ABC試劑室溫孵育2 h，再次充分洗片后，添加含有顯色增強劑的0.05%DAB顯色劑顯色；在顯微鏡下控制嚴格顯色時間，顯色符合要求后加PBS終止顯色；充分漂洗后明膠玻片貼片，乙醇濃度梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，待鏡檢。

1.3 顯微鏡下檢測計數及圖像處理

光學纖維鏡下分別對幼犬腦組織腦皮層、白質、室管膜下區、海馬和齒狀回進行觀測，觀察DCX在各觀測區的分布表達情況，同時使用圖像采集系統采集圖像；10×20倍光鏡下觀測計數各觀測點的陽性細胞表達數及細胞形態，每個觀測區選取6個視野觀測計數；采集的圖片使用軟件Photoshop 9.0進行處理。

1.4 統計方法

采用SPSS 21.0統計學軟件分析數據，觀測數據以均數±標準差（±s）表示，進行t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 微管相關蛋白在腦各觀測區的表達情況

腦皮層的表達分布情況：在腦皮層中除I層外，均有DCX陽性表達，細胞形態呈典型神經元形態，細胞突較長且染色明顯，突起伸展方向基本一致，與腦皮層垂直。腦皮層I層未能觀測到陽性表達，II表達明顯，圍繞皮層呈現連續線狀分布狀態，細胞突起較長，可見部分突起伸展至I層內（圖1中A和B，圖中箭頭指示神經元長的突起）。II層下陽性細胞散在分布，不及II層內的細胞分布規律，突起伸展方向亦與腦表面垂直；室管膜下區的表達分布情況：室管膜下區為神經生發區，圍繞著室管膜觀測到DCX的強陽性表達，越靠近室管膜陽性細胞表達越密集分布，近室管膜處細胞突起相對較短，但相互交錯分布，深層陽性表達細胞相對稀疏，但神經元突起較長，朝向基本一致，成簇狀分布。近室管膜區白質中可觀測到成簇分布的陽性細胞群，群中的未成熟神經元突起方向基本一致，形成神經遷移流，（圖1中C和E，箭頭指示為成簇分布的遷移神經元群）；海馬表達情況：在海馬區陽性細胞較少，表達相對較弱，陽性細胞呈現線狀分布，突起明顯染色且長軸與海馬細胞層相垂直，海馬區的未成熟神經元源自齒狀回神經生發區，通過遷移最終定位于海馬細胞層 （圖1中D）；白質表達情況：在白質中靠近室管膜下區有成簇分布的陽性細胞表達，越靠近腦皮層，陽性細胞表達呈現下降趨勢，成簇的陽性細胞形成神經元遷移流，新生神經元不斷離開遷移流在白質中遷移分化，最終定位成熟于皮層（圖1中C和E）；齒狀回表達情況：齒狀回顆粒下層觀測到濃染的陽性細胞表達，陽性細胞密度較大，呈線狀分布，為神經生發區之一。陽性細胞體整齊排列，相互間距離較小，一側細胞突起較長且朝向一致，呈發射狀伸入顆粒細胞層（圖1中F）。

圖1 DCX在幼犬腦各區的表達（A和B：DCX在腦皮層的表達；C和E：DCX在室管膜下區及白質的表達；D和F：DCX分別在海馬和齒狀回的表達。CS：腦溝 SR：室管膜下區 LV：側腦室 SGZ：齒狀回顆粒下層）

2.2 各觀測區陽性細胞計數結果

室管膜下區陽性細胞表達最高，與腦皮層、白質和海馬差異有統計學意義（P＜0.05），齒狀回顆粒下層陽性細胞表達較高，與皮層、白質和海馬差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表1。

表1 陽性細胞在各觀測區比較（±s）

表1 陽性細胞在各觀測區比較（±s）

注：與齒狀回比較，aP＞0.05，bP＜0.05；與室管膜下區比較，bP＜0.05。

觀測區陽性細胞計數齒狀回顆粒下層室管膜下區腦皮層腦白質海馬2 9.7 0±2.1 4（2 7.3 0±2.4 1）a（1 2.0 0±1.3 2）b（1 8.5 0±1.8 8）b（6.8 3±1.1 8）b

3 討論

該實驗以幼犬作為實驗研究對象，重點觀測了室管膜下區、腦皮層、海馬、齒狀回等部位的DCX表達分布情況，其中室管膜下區和齒狀回DCX表達最高[室管膜下區陽性細胞：（27.30±2.41），齒狀回陽性細胞：（29.70±2.14）]， 室管膜側壁下層觀測到密集的陽性表達，細胞突起不明顯，在室管膜下區白質中觀測到神經細胞密集分布的神經遷移流 [陽性細胞：（18.50±1.88）]，新生神經元前導突起伸展方向基本一致，朝向白質。齒狀回觀測到濃染的新生神經元，一側神經元突起明顯，伸入分子層。說明哺乳動物在出生后早期其腦內仍有活躍的神經發育現象存在，神經生發區位于室管膜下區和齒狀回，哺乳動物的神經發育在胚胎時期仍未完成，出生后神經發育處于持續狀態。與其他學者在對成年大鼠的神經元前體細胞研究結果比較[5]，該研究發現大鼠神經前體細胞標記物DCX主要分布在室管膜下區、齒狀回顆粒下層、吻側遷移流和嗅球，其中室管膜下區DCX陽性細胞密度最高[陽性細胞：（20.45±3.74）]，在吻側遷移流中陽性細胞[陽性細胞：（15.47±3.64）]排列有序，神經細胞前導突起方向基本一致，在齒狀回顆粒下層中陽性細胞[陽性細胞：（18.83±4.35）]表達與室管膜下區表達相近，未成熟神經元前導突起單側一致朝向分子層，嗅球中觀測到大量的新生神經元 [陽性細胞：（19.79±7.24）]離開神經遷移流，向嗅球皮層遷移。該實驗研究未觀測嗅球的表達情況，其余觀測區結果與成年大鼠觀測區觀測結果比較，幼犬觀測區陽性細胞數量略偏高，是由于本實驗使用的動物為出生后早期的哺乳動物，出生后早期神經發育處于較為旺盛的階段，而上述學者采用的實驗動物為成年大鼠，成年大鼠的神經再生在成年階段神經發育處于完結狀態，即為成年“保持”狀態，但就神經再生的生發區而言，成年大鼠和幼犬的室管膜下區和齒狀回都保持有旺盛的神經再生功能，大鼠腦組織神經發育研究結果與該實驗研究結果基本一致。成年大鼠的研究中未提及腦皮層II中有陽性細胞表達，是由于成年大鼠腦皮層II中不存在未成熟神經細胞，該結果的差異是由于實驗動物的種屬選擇不同造成的。該實驗研究中實驗動物為幼犬，在其腦皮層II層中明確觀測到呈線狀排列的未成熟神經元[陽性細胞：（12.00±1.32）]，神經細胞突起明顯并伸展至皮層I層，有的學者認為該部位也是神經生發區之一，但該區是否是神經生發區諸多學者間仍存在分歧[6]。所以幼犬完全可作為神經發育研究的實驗動物的理想選擇。

近數十年的研究表明哺乳動物在出生后其腦內存在著一些區域，這些區域仍然存在著較為旺盛的神經生發功能，隨著年齡的增長該功能呈現下調趨勢[7]。哺乳動物在生活期間受到外界刺激或腦組織受到外傷后，這些區域的功能將會再次被激活上調，表現為神經再生功能，該功能是哺乳動物神經系統的功能儲備[8]。這些特定的腦功能區集中于室管膜下區（SVZ）和齒狀回顆粒下層（SGZ），實驗表明這些區域終身存在具有增殖功能的神經前體細胞。其中室管膜下區存在有大量的神經前體細胞，是重要的神經生發區之一，該區域產生的未成熟神經細胞群形成吻側遷移流（RMS）在遷移的過程中不斷分化，遷移至哺乳動物嗅球，然后離開遷移流再遷移至嗅球皮層，分化成為中間神經元[9]。楊樹旭等[10]學者在研究腦出血對DCX表達影響的研究中觀測到：基底節腦出血動物模型中，與對照側比較，DCX陽性細胞首先表達于室管膜下區，并且靠近出血側神經干細胞增殖明顯，反而在神經生發區齒狀回未檢測到新生神經元的增加，這說明腦損傷誘發的腦神經再生的分子機制還不為人所知。

對鼠類的幼年期和成年期的神經發育研究中發現出生后幼鼠腦組織內仍然存在有大量的新生神經元，說明哺乳動物出生后早期腦內仍然存在有神經生發區，不斷產生的新生神經元隨神經遷移流不斷遷移，最終定位于腦組織不同部位完成神經發育。成年后鼠腦內的特定部位依然存在有神經生發區，雖然與幼鼠相比該功能有所下調，但受到外界刺激或腦損傷后，該功能將會被再次激活上調，不斷生成新的神經元。周艷玲等人[11]通過對大鼠實施慢性復合應激后發現實驗動物的海馬齒狀回新生神經元增多，動物的學習記憶能力明顯增強，說明外界刺激可上調海馬的神經功能。Aevidsson A等人[12]通過對腦損傷的研究認為：腦損傷可誘發腦內神經生發區神經前體細胞增加，但新生神經元通過定向遷移至腦損傷區，與周圍神經元形成突觸并完成構建完整的神經元回路，是實現神經功能修復的重要過程，但研究發現絕大多數的新生神經元未能完成上述過程而陸續死亡，僅僅有0.2%新生神經元存活，并替代受損區神經元發揮正常功能，了解掌握其中的神經再生機制并進行人為干預，對于治療腦損傷具有非常重要的意義。

Doublecortin（DCX）是近年來發現的一種在神經發育中起調節作用特異性微管相關蛋白，參與了神經元骨架的構成，該蛋白位于神經前體細胞中，同時在處于遷移狀態的未成熟神經元中位于胞體和前導突起中，在新生神經元前導突起中微管蛋白通過改變自身結構，可使神經元以伸展和回縮兩種交替形式發生遷移[13]，對于神經元的定向移動遷移具有重要作用，保證了神經元遷移的穩定性。Doublecortin在中樞神經系統中已被大量發現，實驗發現鼠腦中從胚齡11 d至出生后早期均有不同程度的DCX表達，胚胎腦組織中發現未成熟神經元從開始遷移直至遷移完成的整個過程中都有DCX表達。所以DCX可作為新生神經元的特異性標記物，對于研究神經發育和神經元的定向遷移有很重要的研究意義。