痛利舒顆粒治療急性痛風性關節炎的實驗研究

王平，孫鐵鋒，國錦，焦園園，劉瑾，趙渤年，高燕

(1.山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014；2.天津大學精密測試技術及儀器國家重點實驗室， 天津 300072；3．山東中醫藥大學，山東 濟南 250014；4.天津中醫藥大學，天津 301600)

痛風是由單鈉尿酸鹽(MSU)沉積所致的晶體相關性關節病，與嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關，包括急性發作性關節炎、痛風石性慢性關節炎和尿酸性尿路結石等疾病，重者可出現關節殘疾和腎功能不全。痛風中高發而且危害較重的一種是急性痛風性關節炎，多因尿酸鹽沉積在關節囊、滑囊、軟骨、骨質和其他組織中而引起病損及炎性反應，易發于40歲以上男性，多見于第一跖趾關節，尤其是踝部與足部關節[1-2]。隨著中國民眾飲食結構發生變化，其發病率連年升高，嚴重影響著患病人群的生活質量[3-5]。痛利舒顆粒為臨床經驗方，由茵陳、澤瀉、梔子等十幾味中藥組成，具有清熱利濕、化瘀止痛、益氣滋陰的功效，臨床上能有效緩解痛風性關節炎發作期的疼痛。為驗證其療效，我們進行了痛利舒顆粒的抗急性痛風性關節炎、抗炎和鎮痛實驗研究。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠90只(雌性，體重18～20 g，許可證號：SCXK(魯)20140007，質量合格證號：No：37009200007866)；SPF級KM小鼠70只(雌雄各半，體重18～20 g，許可證號：SCXK(魯)20140007，質量合格證號：No：37009200007636)；SPF級SD大鼠70只(雄性，體重180～200 g，許可證號：SCXK(魯)20140007，質量合格證號：37009200008127)；均由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。

1.2 藥品

痛利舒顆粒(山東省中醫藥研究院中心實驗室課題組提供，批號：20170511；成人日服3次，每次12 g。各項實驗痛利舒顆粒均設3個劑量組，低劑量組相當于臨床等效劑量，中、高劑量組為臨床等效量的2倍和4倍)；痛風定膠囊(四川升和藥業股份有限公司，批號：1611101，成人日服3次，每次1.6 g，實驗所用劑量為其臨床等效量的2倍)；布洛芬片(山東新華制藥股份有限公司，批號：1703067，成人日服2次，每次0.4 g，實驗所用劑量為其臨床等效量的2倍)；吲哚美辛片(上海金不換蘭考制藥有限公司，批號：20160201，成人日服3次，每次25 mg，實驗所用劑量為其臨床等效量)；別嘌醇片(廣州彼迪藥業有限公司，批號：20170505，成人日服2次，每次0.53 g，實驗所用劑量為其臨床等效劑量)。

1.3 試劑

巴豆油(梯希愛(上海)化成工業發展有限公司，批號：5MXNJ-JQ)；尿酸鈉鹽(Sigma公司，批號：BCBS7438)；生理鹽水(辰欣藥業股份有限公司，批號：1708142704)；戊巴比妥鈉(默克化工技術(上海)有限公司，批號：20171017)；吐溫80(天津市光復精細化工研究所，批號：20150106)；大鼠血清TNF-α ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20171009)；大鼠血清IL-6 ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20171009)。

1.4 儀器

YLS-6B型熱板儀(上海精密儀器儀表有限公司)；BT125D型電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；ENDURA E0541型游標卡尺(力易得格林利工具(上海)有限公司)；TDL408型低速離心機(上海安亭科學儀器廠)；9 mm打孔器。

2 實驗方法

2.1 痛利舒顆粒對急性痛風性關節炎大鼠模型的影響

2.1.1 尿酸鈉注射懸液配制

取250 mg 結晶性尿酸鈉, 加入0.9%氯化鈉注射溶液9 mL，再加1 mL吐溫 80，加熱攪拌，配制成10 mL尿酸鈉混懸溶液，濃度為12.5 mg/mL。

2.1.2 1%戊巴比妥鈉溶液配制

稱取戊巴比妥鈉2.5 g，加至250 mL生理鹽水中，搖勻，即得。

2.1.3 SD大鼠急性痛風性關節炎模型的制備

采用經典Cdoerre急性痛風性關節炎大鼠造模方法[6-11]。用6號注射針在受試大鼠右側踝關節背側從 45°方向插入脛骨肌腱內側，感覺有落空感后，將0.2 mL尿酸鈉溶液(25 mg/mL)注入到踝關節腔，以關節囊對側鼓起為造模標準，形成急性痛風性關節炎模型。空白對照組注入等體積的生理鹽水-吐溫80。

2.1.4 動物分組與給藥

將造模SD大鼠按體重隨機分為7組，每組10只，分別為空白對照組、模型對照組，痛風定膠囊組，吲哚美辛組，痛利舒高、中、低劑量組(12.96 g/kg、 6.48 g/kg、3.24 g/kg)。各組動物灌胃給予相應藥物，空白對照組和模型對照組均灌胃給予等容量的生理鹽水，灌胃容積10 mL/kg，連續給藥 7 d。

2.1.5 指標測定

2.1.5.1 大鼠足踝關節直徑測量

造模前于大鼠右后足踝關節上方 1.0 cm處用編號筆作一橫線標記，并用游標卡尺測量踝關節直徑。造模后第一天分別在 4 h、8 h 測量右后足踝關節直徑，計算關節腫脹度。每天測1次，連續 7 d。

踝關節腫脹程度=造模后踝關節直徑-造模前踝關節直徑

2.1.5.2 血清IL-6、TNF-α含量的測定

大鼠末次灌胃3 h后，1%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血5 mL，靜置30 min后，以3 000 r/min的轉速離心10 min，分離血清，采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清中 TNF-α、IL-6水平。

2.2 痛利舒顆粒對熱板法測定小鼠痛閾值的影響

2.2.1 實驗動物篩選

KM種小鼠90只，雌性，體重20±2 g，將小鼠置于可調恒溫熱板儀上，溫度控制在55±0.5 ℃，用秒表記錄小鼠自放在熱板上至出現舔后足所需時間(s)作為該鼠的痛閾值[12-13]。凡痛閾值小于5 s或大于30 s 或喜跳躍者棄之不用。重復測定其痛閾值2次，取兩次痛閾平均值，作為該鼠給藥前痛閾值。

2.2.2 動物分組與給藥

選擇痛閾值符合實驗要求(5 s<給藥前痛閾值<30 s)的合格小鼠60只，隨機分為6組，每組 10 只，分別為空白對照組、布洛芬組、痛風定組、痛利舒低、中、高劑量組(4.68 g/kg、9.36 g/kg、18.72 g/kg)。各給藥組分別灌胃給予相應藥物，空白對照組灌胃給予等容量的生理鹽水，給藥容積25 mL/kg，每日灌胃 1 次，連續給藥7 d。

2.2.3 指標檢測

末次給藥后分別于30、60、90、120 min測定痛閾值1 次，如60 s仍無反應，將小鼠取出，以免燙傷，其痛閾值以60 s計算。按下列公式計算痛閾提高率：

2.3 痛利舒顆粒對巴豆油所致小鼠耳廓腫脹的影響

2.3.1 2%復合巴豆油的配制

取巴豆油0.5 mL，無水乙醇5 mL，蒸餾水1.25 mL，乙醚18.25 mL，混勻，即得2%復合巴豆油溶液25 mL。

2.3.2 實驗分組與給藥

KM小鼠 70 只，適應性喂養 3 d后按體重隨機分為 6組：空白對照組、布洛芬組、痛風定膠囊組、痛利舒低、中、高劑量組(4.68 g/kg、9.36 g/kg、18.72 g/kg)。每組 10 只，各給藥組分別灌胃給予相應藥物，空白對照組灌胃給予等容量的生理鹽水，給藥容積25 mL/kg，每日給藥1次，連續給藥7 d。

2.3.3 指標檢測

末次給藥1 h后，用微量移液器將2%復方巴豆油致炎液20 μL均勻涂于每只小鼠的右耳正反兩面致炎[14-15]，左耳不涂作對照，4 h 后脫頸椎處死小鼠，沿著小鼠耳廓基線剪下兩耳，用直徑9 mm 的打孔器分別在兩耳的同一部位打下圓耳片，用電子天平稱重，每鼠的右耳片重量減去左耳片重量即為腫脹程度。計算各組腫脹度之平均值與標準差，并按公式計算給藥組的腫脹抑制率(%)。

耳腫脹度=右耳片質量-左耳片質量，

3 統計學分析

4 實驗結果

4.1 痛利舒顆粒對急性痛風性關節炎大鼠模型踝關節腫脹程度的影響

造模前，各組大鼠精神佳，進食及飲水正常，體重增長正常，毛色白而有光澤。造模后，除空白對照組外，其余各組大鼠精神欠佳，活動減少，進食減少，飲水增多，毛色干枯發暗，體重基本無增長甚至略有減輕。造模后 2 h，除空白對照組外各組大鼠右側踝關節均出現明顯的皮膚發紅，造模處皮膚發熱，關節腫脹，空白對照組關節處出現略微腫脹。

由表1結果可見，造模24 h后，與空白對照組比較，模型對照組踝關節腫脹程度明顯增加，差異具有顯著性意義(P<0.05)，表明急性痛風性關節炎大鼠模型建立成功。造模24、48、72、144 h后，痛利舒高劑量組踝關節腫脹程度與模型對照組比較明顯減輕，差異具有極顯著性差異意義(P<0.01)，提示痛利舒高劑量組能明顯改善SD大鼠的踝關節腫脹程度。中劑量組和低劑量組在造模24、48、72、144 h后也可以改善踝關節腫脹程度，但是部分時間點未出現顯著性差異(P>0.05)，痛風定組可以改善踝關節腫脹程度，但沒有顯著性差異(P>0.05)；吲哚美辛片組在144 h與模型組比較具有極顯著性差異(P<0.01)。以上結果表明，痛利舒顆粒能明顯減輕急性痛風性關節炎大鼠模型踝關節腫脹程度，具有明顯的抗炎作用。

表1 痛利舒顆粒對急性痛風性關節炎大鼠模型踝關節腫脹程度的影響

注: 與空白對照組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

4.2 痛利舒顆粒對急性痛風性關節炎大鼠模型血清IL-6、TNF-α含量的影響

由表2結果可見，與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6含量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)，說明造模成功。與模型對照組比較，吲哚美辛組、痛風定組及痛利舒顆粒低、中、高劑量組均可以明顯降低血清TNF-α、IL-6水平，說明陽性對照藥組及痛利舒各劑量組均可降低尿酸鈉致踝關節腫脹大鼠模型的血清中異常升高的TNF-α和IL-6水平。本實驗結果表明，痛利舒顆粒對急性痛風性關節炎大鼠具有良好的抗炎作用。

表2 痛利舒顆粒對急性痛風性關節炎大鼠模型血清IL-6、TNF-α含量的影響Table 2 Effect of Tonglishu Granule on serum IL-6 and TNF-α contents in rat model of acute gouty

注: 與空白對照組比較#P<0.05,##P<0.01；與模型對照組比較*P<0.05，**P<0.01 。

4.3 痛利舒顆粒對熱板法測定小鼠痛閾值的影響

由表3、表4結果可見，與空白對照組相比，布洛芬組和痛風定組給藥后均表現出明顯的鎮痛作用(P<0.01)。痛利舒顆粒各劑量組末次給藥30 min后，隨著時間和劑量的增加痛閾值也增加，呈正相關，高劑量組效果最好。其中高劑量組與空白組比較，30、60、90 min時間點痛閾值具有顯著性差異(P<0.05,P<0.01), 120 min時間點沒有顯著性差異(P>0.05)。結合小鼠痛閾值提高率可以發現，痛利舒顆粒作用緩和，時間相對持久。綜上所述，痛利舒顆粒可以提高小鼠痛閾值，有很好的鎮痛作用。

表3 痛利舒顆粒對熱板法所致小鼠疼痛模型痛閾值的影響

注：與空白對照組比較*P<0.05，**P<0.01 。

表4 痛利舒顆粒對熱板法所致小鼠疼痛模型痛閾提高率的影響Table 4 Effect of Tonglishu Granule on the increase of pain threshold in mouse pain model induced by hot plate method

4.4 痛利舒顆粒對巴豆油所致小鼠耳廓腫脹的影響結果

實驗過程中小鼠精神狀態良好，皮毛光滑，大便正常，墊料隔天更換一次，實驗過程中小鼠無死亡。由表5可見，與空白對照組比較，布洛芬組、痛利舒顆粒中、高劑量組顯示出明顯的抗炎效果，差異具有統計學意義(P<0.01 或P<0.05)，其中陽性對照藥布洛芬的抗炎效果最顯著。痛風定組未出現較為明顯的抗炎效果，差異不具有統計學意義(P>0.05),但耳腫脹度相比空白對照有下降趨勢。

表5 痛利舒顆粒對巴豆油所致小鼠耳廓腫脹的影響Table 5 Effect of Tonglishu Granule on the swelling of mouse ear caused by croton

注: 與空白對照組比較*P<0.05，**P<0.01 。

5 討論

中醫認為痛風屬于“痹癥”，氣血運行不暢，濁瘀滯留關節，才會出現關節炎癥和腫脹等臨床表現。急性痛風性關節炎為痛風發作期的典型表現，中醫認為，此病多見于青壯年男性，因多食肥甘油膩、酒肉之品，脾運虛弱，濕濁內蘊，熱毒內結而發病。有研究表明，急性痛風性關節炎患者血清及組織里會產生出多種細胞促炎因子，如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等，可促使炎癥范圍不斷擴大，發生關節紅腫、皮溫增高、劇烈疼痛以及出現不同程度的關節功能障礙。其中，TNF-α和IL-6為炎癥反應出現時較為關鍵的細胞因子。TNF-α 是由巨噬細胞在細菌感染或免疫源反應過程中分泌的小分子蛋白，作為炎性反應的重要啟動因子，能促進IL-1、IL-6等炎性因子的生成，增強中性粒細胞對血管內皮的粘附性，進而形成復雜的細胞因子作用網絡，放大炎性反應。IL-6 為巨噬細胞的激動劑,為經典的炎癥因子調節劑，控制著炎癥介質的產生和分泌, 進而加重機體的炎性反應。IL-6可促進炎癥相關的 B 細胞和 Th17 細胞的分化以及急性期蛋白的合成，誘導破骨細胞分化，造成關節損傷。故本實驗在對急性痛風性關節炎進行研究時，著重觀察痛利舒顆粒對關節炎大鼠的踝關節腫脹程度的改善作用，并測定TNF-α和IL-6的濃度，探究TNF-α和IL-6水平與急性痛風性關節炎的關系。

痛利舒顆粒為臨床經驗方，茵陳、澤瀉、梔子三君藥相合，共奏清熱利水滲濕、止痛解毒之效，丹參、葛根以活血化瘀，牛膝發揮其引經報使之功。全方具有清熱利濕、化瘀止痛、益氣滋陰之效。實驗結果表明，痛利舒顆粒各劑量組能有效緩解關節炎大鼠踝關節腫脹程度，顯著降低大鼠血清中的TNF-α、IL-6水平，提高小鼠的痛閾值，降低小鼠的耳腫脹程度，說明痛利舒顆粒具有良好的消腫鎮痛抗炎作用。綜上所述，痛利舒顆粒對急性痛風性關節炎具有良好的治療作用，且作用強度與劑量具有一定的量效關系，但對于降低某些指標不如西藥明顯，應進一步開發研究該經驗方，探究其在防病、治病方面的新用途或新優勢。