五味保肝丸對酒精性肝損傷小鼠的保護作用及機制研究

楊青，于爽，孫晶，徐志龍，謝旭善，張偉

(青島市海慈醫(yī)療集團，山東 青島 266033)

酒精性肝損傷是由于長期飲酒所引起的肝臟疾病，發(fā)病率逐年升高，是僅次于病毒性肝炎的第二大肝病[1]。目前，酒精性肝病的發(fā)病機制尚不明確，而且臨床用藥的治療效果并不理想。五味保肝丸(降酶丸)是青島市海慈醫(yī)療集團傳統(tǒng)的中藥自制制劑品種(魯藥制ZBZ1077)，由五味子、丹參、山楂等五味中藥組成，具有斂陰、活血、降酶的功效，用于乙型肝炎、轉(zhuǎn)氨酶升高等病癥的治療，效果顯著。本院對五味保肝丸的前期研究表明，該制劑能夠在一定程度上減輕CCl4所致的大鼠急性肝損傷，改善肝功能[2]。為了進一步探討五味保肝丸的降酶保肝作用，本文觀察了五味保肝丸對酒精性肝損傷小鼠的保護作用以及對肝微粒CYP450以及CYP2E1活性的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品與試劑

五味保肝丸(青島市海慈醫(yī)療集團制劑室)；紅星二鍋頭白酒(北京紅星股份有限公司生產(chǎn)，酒精度56%)；ALT、AST試劑盒(南京建成生物研究所)； BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；兔抗小鼠CYP2E1抗體、β-actin抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(南京巴傲得生物科技有限公司)。

1.1.2 實驗動物

健康昆明種小鼠，雄性，體重18～20 g，共50只，購自青島市實驗動物和動物實驗中心。

1.1.3 實驗儀器

7020型全自動生化分析儀(日本日立公司)；MK3型酶標(biāo)儀(上海賽默生物科技有限公司)；FSH-Ⅱ型高速電動勻漿機(江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠)；凝膠垂直電泳、蛋白轉(zhuǎn)印裝置、凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及各組處理

將50只小鼠隨機分成正常對照組、模型組和五味保肝丸低、中、高3個劑量組，每組10只。正常對照組和模型組給予羧甲基纖維素鈉溶液，五味保肝丸低、中、高3個劑量組分別給予0.125、0.25、0.5 g/(kg·d)的五味保肝丸混懸液。每日灌胃給藥1次。給藥2 h后，正常對照組灌胃給予生理鹽水，其余組灌胃給予白酒(12 mL/kg)，每天一次，連續(xù)10 d。末次給藥后，小鼠自由飲水、禁食24 h后眼眶靜脈叢采血1 mL于離心管，靜置30 min，4 500 r/min離心，分離血清。取血后，將小鼠脫臼處死，迅速開腹，取出肝臟。

1.2.2 血清生化指標(biāo)的測定

按照生化測定試劑盒說明書，對小鼠血清ALT、AST含量進行檢測。

1.2.3 小鼠肝微粒體CYP450的含量測定

式中，Y為CYP450含量， nmol/mg；A為450 nm、 490 nm波長測定值；E為CYP450的毫摩爾消光系數(shù)，91 cm2/mmol；C為稀釋后微粒體懸液蛋白質(zhì)量濃度， mg/mL；r為比色杯光徑長度， cm。

1.2.4 Western Blot法檢測小鼠肝組織CYP2E1的表達(dá)

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均采用x±s表示，用SPSS 11.0軟件進行分析，組間比較采用t檢驗，各組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P<0.05 表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 五味保肝丸對酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST含量的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠血清中ALT、AST含量顯著升高，表明酒精性肝損傷模型造模成功。五味保肝丸低、中、高劑量組均能降低肝損傷小鼠血清中ALT、AST含量，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 五味保肝丸對酒精性肝損傷小鼠肝微粒CYP450含量的影響

模型組與正常對照組相比，肝組織中肝微粒CYP450含量顯著下降。與模型組相比，五味保肝丸三個劑量組均能升高小鼠肝組織中肝微粒CYP450，且呈劑量依賴性關(guān)系，其中，五味保肝丸中、高劑量組與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.3 五味保肝丸對酒精性肝損傷小鼠肝微粒體CYP2E1含量的影響

采用Western Blot檢測小鼠肝微粒體CYP2E1含量的變化，結(jié)果如圖1所示。小鼠灌胃給予白酒后，肝微粒體CYP2E1表達(dá)顯著增強，而五味保肝丸低、中、高劑量組與模型組相比，均能夠抑制肝微粒體CYP2E1的異?；罨?，且隨著五味保肝丸劑量增加，效果增強，提示五味保肝丸能夠抑制酒精誘導(dǎo)的CYP2E1表達(dá)升高。

表1 各組小鼠血清ALT、AST含量比較

注：與正常對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

表2 各組小鼠肝微粒體CYP450含量比較

注：與正常對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

1正常對照組； 2 模型組； 3 五味保肝丸低劑量組； 4 五味保肝丸中劑量組； 5 五味保肝丸高劑量組。圖1 五味保肝丸對酒精性肝損傷小鼠肝微粒體CYP2E1含量的影響Fig.1 Effect of WBW on liver microsomal CYP2E1 content in mice with alcoholic liver injury

3 討論

肝臟是機體重要的代謝器官，各種因素引起的肝損傷都會導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死或凋亡，引發(fā)后續(xù)的炎癥和纖維化病變，表現(xiàn)為脂肪肝、肝硬化、肝癌等疾病。酒精性肝損傷的發(fā)病機制尚未明確，中醫(yī)認(rèn)為其病理基礎(chǔ)為肝血瘀阻，常以疏肝清熱、活血祛瘀為主要治療原則[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，酒精性肝損傷與乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛引起的肝毒性、代謝障礙、氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng)等多種因素有關(guān)[6-7]。

細(xì)胞色素P450(CYP450)酶系是由許多同工酶組成的微粒體混合功能氧化酶，參與多種生理性物質(zhì)、毒性致癌物以及約90%常用藥物的代謝和轉(zhuǎn)化。肝臟CYP450的酶活性下降會導(dǎo)致肝臟解毒能力降低，肝臟損害增加。CYP450基因和表型存在高度多態(tài)性，在藥物代謝作用中, 最重要的亞型有CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1等[8]。

CYP2E1是CYP450的重要亞型，約占CYP450總量的7%[9]，乙醇是CYP2E1誘導(dǎo)劑，可誘導(dǎo)增加乙醛的產(chǎn)生，加速自由基生成，加重氧化損傷，代謝產(chǎn)物如丙二醛能夠誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，加重酒精性肝損傷[10-11]。實驗結(jié)果表明，不同劑量五味保肝丸能夠抑制ALT、AST水平的升高，抑制肝微粒體CYP2E1的異常活化，但明顯提高肝微粒體CYP450的酶活性，這可能是由于五味保肝丸能夠作用于肝微粒體CYP450酶系中的其他亞型，誘導(dǎo)其酶活性增加，從而引起肝微粒體CYP450總酶活性增加，增強肝臟解毒能力。

綜上所述，五味保肝丸對小鼠酒精性肝損傷具有一定的保護作用，其機制可能是通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減輕氧化損傷，抑制肝微粒體CYP2E1的異?；罨吒挝⒘ｓw細(xì)胞色素P450水平，增強肝臟的解毒能力，發(fā)揮保肝降酶的作用。該研究為五味保肝丸的臨床合理用藥及藥物聯(lián)合應(yīng)用提供了進一步的理論依據(jù)。