基于高通量測序的兩種高寒草甸土壤原核生物群落特征研究

盧 慧,趙 珩,盛玉鈺,叢 微,王秀磊,李迪強,張于光,*

1 中央民族大學生命與環境科學學院,北京 100081 2 中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所,國家林業局森林生態環境重點實驗室,北京 100091

土壤微生物參與了生態系統的各種重要的生態功能,是評價生態系統各種地下生態與生物地球化學循環過程對環境變化的響應的一個重要指標[1],近年來,已有研究報導了不同環境下土壤微生物的群落組成,有學者認為微生物群落的控制因子會隨著研究尺度的不同而發生改變[2]。Zhang等[3]發現土壤微生物群落的分布受到緯度梯度的影響,而更多的研究認為微生物多樣性沿海拔梯度的變化不同[4- 5],pH[6]、土壤養分[7]、土壤溫度[8]或其他因子也可能是影響微生物群落組成的主要因子。

氣候變化對各種生物都會產生很大影響[9]。由于高海拔和極端的氣候條件,青藏高原是生態脆弱地區,極易受到環境干擾[4]。高寒沼澤化草甸是青藏高原高寒草甸草地的重要組成部分, 是一種草甸與沼澤之間的過渡植被類型,面積為4.9×104km2,是青藏高原分布面積較廣的草地生態系統之一[10]。受到氣候暖干化的影響,多年凍土出現退化,使得土壤表層含水量下降,植物群落隨之發生變化,從而由高寒沼澤化草甸演替為高寒草甸[11]。有學者認為,植物演替會對土壤微生物的群落結構產生顯著影響,甚至還會在很大程度上影響到土壤碳、氮含量的動態變化[12]。因此,作為青藏高原獨有的高寒草甸生態系統,研究氣候變化對土壤原核生物的影響及其響應是十分必要的,對研究該區域獨特的微生物地理區系和預測全球環境變化的影響有重要意義。

近年來,關于高寒生態系統的研究多集中于植被覆蓋度[13]、植物群落結構[14]、植物第一性生產力[15-16]、土壤碳循環或氮循環[17-18]等方面,而對草甸生態系統土壤微生物的研究還處于起步階段。隨著分子生物學的發展,高通量測序技術作為研究微生物群落組成的有效手段,已被廣泛應用于微生物學的研究領域中,它可以通過對從土壤中提取的微生物總DNA進行測序和比較分析,快速的對微生物進行有效鑒定[19]。目前,由于受到研究技術和分析方法的局限,大部分的微生物多樣性研究都集中在物種的多樣性和豐富度等方面,沒有考慮微生物物種或種群間的相互作用,而分子生態網絡(Molecular Ecological Networks)分析方法[20]的構建為預測微生物群落組成和多樣性對各種環境變化的可能響應提供了新的機遇。本研究以青藏高原三江源地區高寒沼澤化草甸和高寒草甸的土壤樣品為研究對象,通過Illumina Miseq高通量測序和分子生態網絡相結合,分析不同高寒草甸類型土壤原核生物群落組成和分子生態網絡特征,并探討影響原核生物群落組成的主要環境影響因子。

1 研究方法

1.1 取樣方法

選擇青海省三江源地區的高寒沼澤化草甸(Alpine swamp meadow,簡稱ASM,34°22′15″N, 97°56′57″E,海拔4480 m)和高寒草甸(Alpine meadow,簡稱AM,35°24′28″N, 99°21′6″E,海拔4140 m)為研究對象,各設立一塊樣地。每塊樣地的坡度、坡向、人為干擾情況盡可能一致。為了在考慮空間異質性的同時降低實際地形的取樣難度,我們采樣時對巢式取樣的方法進行了簡化,進行了“L”形取樣[21]。即在每塊樣地設立1個200 m×200 m的網格,以網格內任意一個角為起點,在水平和垂直方向上距離分別為10,20,50,100 m和200 m處設置1 m×1 m的樣方,每塊樣地內設立10個1 m×1 m樣方,共20個樣方。在每個1 m×1 m的樣方內采用對角線取樣法采集土壤樣品,取樣深度為0—10 cm,混合后過篩,分成2份,1份低溫保存用于土壤理化性質分析,1份-80℃保存用于DNA提取。同時記錄采樣地點經緯度、地形等。

1.2 土壤理化性質和植物多樣性測定

在每個樣方中,調查植物種類、多度、高度、蓋度等指標,計算重要值。物種多樣性的測定采用物種豐富度指數和香農多樣性指數來表征。

1.3 高通量測序

土壤DNA的提取主要參考Zhou等[23]的方法進行。利用土壤基因組DNA提取試劑盒(MP Biomedical, Carlsbad,CA)先粗提土壤樣品DNA,然后利用0.5%的低熔點的瓊脂糖凝膠對樣品DNA進行純化,利用NanoDrop ND- 1000分光光度計(Nanodrop Inc)檢測樣品DNA純度,若A260nm/280nm>1.80,A260nm/230nm>1.70則表明樣品DNA符合要求。最后,利用FlUOstar Optima(BMG Labtechm Jena,Germany)方法對純化后的DNA進行定量。

以樣品DNA為模板,根據16S rRNA的V4高變區設計引物,其正向引物為5′-GTGCCAGCMGCCGCGG TAA- 3′ (515F),反向引物為5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′ (806R)[24],在PCR反應體系中進行擴增。PCR反應體系參照Ding等[8]的方法。將600 μL的混合液放入Illumina Miseq(Illumina,San Diego,CA)平臺(2×150個序列讀長)進行測序。

原始序列根據Barcode區分不同的樣本序列,利用FLASH算法[25]處理原始序列的前末端和后末端,將測得的序列進行比對分析,去掉低質量、較短序列和無法比對到16S rRNA數據庫的序列以保證數據的可靠性。根據UCLUST方法[26],將樣點序列以≥97%的相似性劃分為1個分類操作單元(Operational Taxonomic Unit, OTU),采用RDP classifier將代表性OTU的序列信息比對至相對應的物種信息[27],最后對所獲得的OTU數據進行處理分析。所有的數據分析在美國俄克拉荷馬大學環境基因組研究所的網站平臺完成(http://zhoulab5.rccc.ou.edu:8080)。

1.4 分子生態網絡構建

分子生態網絡是基于隨機矩陣理論[20],通過在線平臺MENA進行構建和數據分析(http://ieg2.ou.edu/mena/),用于研究微生物網絡互作關系。為確保OTU相互關系的準確性,在構建網絡時,去除同一樣地10個平行樣品中出現次數低于70%的OTUs。網絡構建時,將基于隨機矩陣理論,自動生成閾值。每個網絡基于快速模塊優化的方法形成不同的模塊。本研究中,不同網絡的拓撲性質通過不同的指數如平均聯系數、平均聚集系數、平均路徑距離、連通性和模塊性[20]來進行表征。網絡節點功能通過模塊內連接度(Zi)和模塊間連接度(Pi)這2個指標來進行劃分,將節點劃分為4大類型：模塊樞紐(Zi>2.5且Pi≤0.62)、網絡樞紐(Zi> 2.5且Pi>0.62)、外圍節點(Zi≤2.5且Pi≤0.62)和連接節點(Zi≤2.5且Pi>0.62)[8]。此外,將環境因子當成網絡節點,與原核生物OTUs一起構建網絡,用來研究原核生物網絡中的關鍵影響因子。

1.5 統計分析

采用Excel和SPSS 18.0軟件利用對數據進行初步統計和差異性檢驗;微生物多樣性通過香農指數和辛普森指數來表征,并計算微生物的物種豐富度;用除趨勢對應分析(Detrended correspondence analysis,DCA)對土壤微生物群落特征進行排序;用典范對應分析(Canonical correspondence analysis,CCA)研究群落分布格局與環境因子的關系;DCA和CCA均使用生物統計學軟件R軟件中的Vegan軟件包[8]進行統計分析。不相似性檢驗均利用在線網站(http://ieg.ou.edu/microarray/)進行分析。采用SigmaPlot 12.5軟件作圖。分子生態網絡采用Cytoscape 3.0軟件進行可視化。

2 結果

2.1 兩種高寒草甸的環境因子特征

對樣地進行植物調查和植物指標計算,結果表明,ASM(高寒沼澤化草甸)樣地的優勢種為藏嵩草(Kobresiatibetica)和矮嵩草(Kobresiahumilis);AM(高寒草甸)樣地的優勢種是矮嵩草和高山嵩草(Kobresiapygmaea)。AM樣地的植物多樣性高于ASM,而植物豐富度低于ASM(表1)。

表1 兩種草甸類型土壤的環境因子比較

2.2 土壤原核生物的多樣性比較

利用Illumina Miseq平臺對土壤樣品進行高通量測序,按照15000序列重新抽樣,基于97%的相似性定位物種水平,共獲得23145個OTUs,其中,ASM樣地檢測到15555個OTUs,AM樣地共檢測到16225個OTUs。香農和辛普森多樣性指數均顯示,AM樣地的原核生物多樣性顯著高于ASM樣地 (P< 0.1)(表2)。

表2 兩種草甸類型的原核生物多樣性

通過除趨勢對應分析(DCA)對原核生物群落組成進行排序,從圖1中可以看出,兩種草甸類型的原核生物群落能基本分開。進一步進行不相似性檢驗(包括MRPP、Adonis和Anosim),結果顯示兩種草甸類型原核生物群落組成差異顯著 (P< 0.001,表3)。

圖1 土壤原核生物群落組成的除趨勢對應分析(DCA) Fig.1 Detrended correspondence analysis of soil prokaryotic community compositionASM：高寒沼澤化草甸,Alpine swamp meadow;AM：高寒草甸,Alpine meadow

Table3Dissimilaritytestofprokaryoticcommunitycompositionbetweentwomeadowtypes

不相似性檢驗Dissimilarity testδ/R/R2PMRPPδ=0.609 < 0.001AnosimR=0.588 < 0.001AdonisR2=0.183 < 0.001

圖2 原核生物群落組成主要門類的相對豐度 Fig.2 Relative abundance in the major phyla of prokaryotic community composition變形菌門,Proteobacteria;酸桿菌門,Acidobacteria;放線菌門,Actinobacteria;擬桿菌門,Bacteroidetes;疣微菌門,Verrucomicrobia; 浮霉菌門,Planctomycetes;厚壁菌門,Firmicutes;綠彎菌門,Chloroflexi;其他,Others;泉古菌門,Crenarchaeota;芽單胞菌門,Gemmatimonadetes

2.3 土壤原核生物的群落組成差異

檢測到的OTUs可劃分為33個細菌門類和2個古菌門類。其中,變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)是優勢門類(圖2),它們在ASM樣地中的相對豐度分別為34.8%、24.7%、11.6%和8.7%,在AM樣地中的相對豐度分別為32.1%、23.1%、19.5% 和6.5%(圖2)。其中,變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門的在ASM樣地中相對豐度較高,而放線菌門在AM樣地中相對豐度較高。

2.4 原核生物的分子生態網絡結構分析

基于RMT算法,利用高通量測序數據構建分子生態網絡,比較兩種草甸類型土壤原核生物網絡聯系上的差異,研究它們之間的網絡互作關系,網絡的拓撲性質見表4。構建的兩種草甸類型的網絡具有相同的閾值(0.890),且均體現了網絡的無尺度特征、小世界特征以及模塊化特征。ASM的網絡包含739個節點和986個連接數,而AM網絡包含860個節點和884個連接數(表4)。比較兩個網絡的拓撲性質,ASM具有較高的連通性和平均聚集系數,而AM具有較長的平均距離和較高的模塊性。

模塊樞紐和連接節點是網絡聯系中的兩大重要節點。從圖3可以看出,ASM含有6個模塊樞紐,其中,4個模塊樞紐屬于變形菌門,1個屬于綠彎菌門以及1個屬于浮霉菌門。而AM含有5個模塊樞紐,2個屬于放線菌門,1個為變形菌門, 1個為疣微菌門以及1個為芽單胞菌門。ASM含有5個連接節點,而AM中不含連接節點。

2.5 影響土壤原核生物群落組成的環境因素

通過構建網絡的方法進一步進行分析,比較原核生物群落組成與環境因子的聯系緊密程度,結果顯示,土壤pH值在所檢測的環境因子中具有最高的連接數目,再次表明了pH值在高寒草甸原核生物群落組成上產生了極其重要的作用(圖5)。

表4 兩種草甸類型的原核生物網絡關系的拓撲性質

圖3 基于網絡拓撲性質的原核生物網絡Z-P分布圖 Fig.3 Z-P plot showing node categories distribution of prokaryotic network based on their topological properties

圖4 原核生物群落與環境因子間的典范對應分析 (CCA) Fig.4 Canonical correspondence analysis of prokaryotic community with environmental factors

圖5 原核生物物種組成與環境因子的網絡互作關系Fig.5 Network interactions between environmental factors and prokaryotic taxonomic community OTUs綠色的點表示與pH直接連接的OTUs,藍色的點表示與pH間接連接的OTUs

3 討論與結論

Illumina MiSeq高通量測序技術的發展提供了一個強大的、高效的平臺,可以幫助我們迅速和有效地確定微生物的群落結構組成[18]。近年來,越來越多的學者關注于土壤微生物優勢菌群的研究,有學者認為,微生物群落的整體組成在不同生境中的差異可能較大,但優勢菌群基本相似,如Shen等[28]通過高通量測序技術對長白山地區土壤微生物的研究發現,變形菌門、酸桿菌門和疣微菌門是微生物主要類群,相對豐度分別為23.1%、20.8%和17.29%。Zhang等[7]對高寒草甸演替過程中微生物群落變化進行了研究,結果表明酸桿菌門、變形菌門、放線菌門和浮霉菌門是優勢菌群。本研究結果表明,兩種草甸類型的原核生物多樣性有顯著差異,而變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和擬桿菌門的是兩種高寒草甸類型中相對豐度最高的重要細菌類群,在兩個樣地中相對豐度累計均超過79%。可以看出,土壤微生物優勢菌群在不同土地類型和不同海拔梯度都具有一定的相似性,這可能是由于這些微生物類群種類最多、分布廣,且個體小、擴散性強,易形成隨機性和廣泛性的分布特點[29],除此之外,微生物生境特異性低,適應環境能力強可能也是一個重要因素[30]。

分子生態網絡作為一種功能強大的工具,可以提供不同物種之間復雜的生態相互作用的重要信息,并揭示微生物結構網絡拓撲結構的變化[31]。ASM網絡較短的平均路徑距離和較高的連通性表明其土壤原核生物之間的相互作用比AM網絡更復雜、更緊密。然而,較短的平均路徑距離意味著局部的干擾可能會更快地傳達到整個網絡[2,32],而緊密連接的群落可能對干擾更加敏感[2],這意味著具有較長路徑距離的AM網絡較ASM網絡更加穩定。ASM網絡的模塊樞紐種類較為單一,大部分OTUs屬于變形菌門,而群落組成的單一化可能導致其聯系較為緊密,對外界的抵抗能力反而較弱[33]。此外,模塊性的比較結果也證實了這一點。網絡模塊性作為網絡系統對抗外界變化的抗性指征[8],在AM樣地中較高,在ASM樣地中較低,說明AM網絡在應對外界環境變化時將具有更高的抗性。

土壤pH值通常是影響微生物多樣性的重要因子之一[6],它與土壤微生物群落結構和組成有著極為緊密的關系,這種相互關系在在不同空間尺度的研究中都有報道,如Shen等[6]發現土壤 pH 值是控制土壤微生物多樣性和群落組成的關鍵性因子,并指出pH值對微生物的分布普遍存在影響;張于光等[34]認為pH值不僅是影響土壤微生物群落結構的主要因素,而且影響了微生物的海拔分布格局。土壤pH值是一個復雜的環境參數,有學者認為,土壤pH值之所以能對微生物的群落結構產生重要影響,可能與土壤pH值能夠對土壤其他因子的變化產生間接的影響有關[35]。本研究中,CCA和分子生態網絡的分析結果均表明,pH值是影響高寒草甸土壤原核生物群落特征的主要因子。

青藏高原草地生態系統在全球氣候變化中扮演著重要角色,對全球氣候變化十分敏感。本文通過對青藏高原特有的代表性的植被類型高寒沼澤化草甸和高寒草甸進行研究,分析其地下原核生物在全球氣候變化下的響應,以期為高寒草甸生態系統的保護性管理和應對氣候變化提供一定的理論依據。