不同施肥方式對酸性茶園土壤真菌群落的影響

季凌飛,倪 康,馬立鋒,陳兆杰,趙遠艷,阮建云,郭世偉,*

1 南京農業大學資源與環境科學學院, 南京 210095 2 中國農業科學院茶葉研究所, 杭州 310008 3 云南省普洱茶樹良種場, 普洱 665000

土壤微生物是土壤生態功能的重要提供者,在土壤有機質周轉、土壤養分轉化、土壤團聚體形成、重金屬及有機污染物降解、溫室氣體排放等物質循環和能量轉化過程中發揮著重要作用[1- 3]。同時土壤微生物群落結構與數量也會隨著植被種類,土壤肥力,土壤pH,降水等環境因子的改變而發生相應的變化[4- 5]。因此,調控土壤中微生物數量與群落結構對增加土壤中養分有效性,改善土壤肥力,提高土壤生產力具有重要意義。

茶樹是我國重要的經濟作物之一,具有喜酸富鋁的特性。自然土壤植茶后,在茶樹自身物質循環以及茶園管理等因素作用下,土壤理化性質會發生一系列變化。例如土壤pH值下降,土壤中Al、F等元素含量增加,而Ca、Mg等鹽基離子和微量元素變得相對缺乏[6]。與其他農作物相比,茶樹是多年生木本植物,且需要周期性修剪以改造樹冠[7]。由于茶樹枝葉富含鋁和茶多酚,此類物質隨著修剪枝葉還田,并不斷在表層土壤富集,分解,顯著改變了茶園土壤的結構和性質,可能會使茶園土壤微生物群落結構有別于其他農業或森林土壤[8- 9]。

目前,茶園土壤細菌群落與功能多樣性已有相關報道[7,10]。但針對茶園土壤真菌群落多樣性的研究卻鮮有報道,僅有袁賽艷等人通過室內培養實驗調查了茶樹修剪物對茶園土壤真菌群落多樣性的研究[11]。而關于不同施肥方式對茶園土壤真菌群落結構的影響卻沒有報道。真菌是土壤微生物群落的重要組成部分,在土壤有機質轉化過程中起著重要作用[12- 14],研究表明土壤真菌群落結構和真菌的多樣性與土壤碳固定過程密切相關[15]。土壤養分狀況的改變,地上部植物生物量變化以及植物的生理活動也會影響土壤的真菌群落結構[16]。施肥是維持茶葉產量與品質的重要措施,同時也是影響土壤肥力與養分狀況的重要因素,研究不同施肥方式對茶園土壤真菌群落結構和多樣性的作用,探討施肥對茶園土壤真菌群落的影響,可以為施肥調控茶園土壤真菌群落提供一定的理論依據。

1 材料方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于云南省普洱市普洱茶樹良種場(101°05′E,22°44′N),海拔1650 m,坡度約25°。屬于亞熱帶季風氣候,年均氣溫15—20.3℃,無霜期在315 d以上,降雨量1100—2780 mm。茶樹品種為“云抗10號”,植茶年限17年。試驗未開始時,表層土壤(0—20 cm)pH為4.24,有機質含量為34.80 g/kg,全氮含量2.70 g/kg,有效磷含量49.88 mg/kg,速效鉀含量97.70 mg/kg。

1.2 試驗設計

試驗始于2011年,包含3個處理：對照(CK),不施氮肥；純施化肥氮(N300),氮用量為300 kg/hm2純氮；70%化肥配施30%有機肥(OM30),氮用量為300 kg/hm2純氮。每個處理設4個重復。每個小區寬6 m,長10 m。氮肥按照1次基肥,3次追肥施用,其中30%氮肥用量施用于11月(基肥),其余氮肥分別作為追肥,分別施用于2月、5月、8月,每次追施量為全年氮肥用量20%。

本試驗中氮肥為尿素,有機肥為菜籽餅。所有處理的磷、鉀、鎂養分投入量一致,其中磷肥用量為(P2O5) 70 kg/hm2,鉀肥用量為(K2O) 150 kg/hm2,鎂肥用(MgO) 40 kg/hm2。所用磷、鉀和鎂肥均為化肥,其中磷肥為過磷酸鈣,鉀肥為硫酸鉀,鎂肥為硫酸鎂。施肥均采用人工開溝條施肥,施肥溝位于茶行中間,深度約15 cm。

1.3 樣品采集與分析

土壤樣品采集于2016年9月,在每個小區內距施肥溝10 cm處。去除土表的凋落物后,分別垂直鉆取0—10 cm和10—20 cm的土壤。每個小區各取15個點,將土壤樣品去除石塊、根系,植物殘體等雜質后混勻,分成兩份。一份置于-80℃冰箱保存,用于提取土壤DNA,將另一份土壤風干,用于土壤的養分測定。

土壤pH值測定：稱10 g風干土樣于50 mL離心管中,加入去CO2蒸餾水25 mL,混合、震蕩,靜置30 min,用pH計(ORION3STAR,Thermo,美國)測定。

土壤全氮(TN)和全碳(TC)測定：稱取1 g過100目的風干土,采用碳氮自動分析儀(ElementarVarioMaxCN,Elementar,德國)測定。

速效磷(AP)、速效鉀(AK)測定：稱取2.5 g過20目的風干土,采用Mehlich3浸提法,土水比1∶10浸提,將濾液稀釋5倍后用ICP-AES(Thermo,TJA,美國)測定。

土壤全磷測定：采用濃硫酸-高氯酸消煮法,稱取過100目篩的風干土壤1 g,加入8 mL濃硫酸,再加入10滴高氯酸消煮[17],消煮結束后將消煮液定容至50 mL,取定容后的消煮液用ICP-AES測定全磷含量；

土壤全鉀測定：采用氫氟酸-高氯酸消煮法,稱取過100目篩的風干土壤1 g,加入8 mL氫氟酸,再加入10滴高氯酸消煮,將消煮液定容至50 mL,取定容后的消煮液用ICP-AES測定土壤全鉀含量[18]。

土壤DNA按照PowerSoilkit(MOBIOLaboratories,Carlsbad,CA,USA)試劑盒的方法提取,隨后對樣本進行ITS2檢測區域的擴增,引物序列如下：PrimerF=Illuminaadaptersequence1+GCATCGATGAAGAACGCAGC；PrimerR=Illuminaadaptersequence2+TCCTCCGCTTATTGATATGC。擴增完畢后建立樣本原始文庫,采用Miseq平臺,2×250 bp的雙端測序策略對文庫進行測序。

1.4 數據分析

測序數據下機后,序列使用QIIME 1.7.0-devpipeline (http://www.qiime.org)進行質控和去嵌合體。OTU(Operational Taxonomic Units) 是在系統發生學或群體遺傳學研究中, 為了便于進行分析,人為給某一個分類單元(品系,屬,種分組等)設置的同一標志。將經過質控后的序列按序列間 97%的相似性歸并到一個OTU單元格中,以備后續 OTU 分類注釋。指控之后共獲得4373014(143931±47440各處理中的平均序列數)條序列,將獲得的序列按樣本中最小序列數70212抽平。之后OTU的代表序列與SILVA數據進行比對,獲得每條OTU代表序列在界、門、綱、目、科、屬、種分類水平上的分組。

處理與土層間的差異采用方差分析(two-way ANOVA),并用LSD方法進行多重比較,顯著性水平設定為α<0.05。

Alpha多樣性指數主要有Observed指數、Chao1指數和Shannon指數,其中Observed指數表示觀測到的OTU數,Chao1指數表示物種的豐富度指數[19],Shannon指數是用來估算樣品中微生物的多樣性指數之一[20]。Shannon值越大,說明群落多樣性越高。Coverage表示測序深度指數。

不同處理之間的Alpha指數差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA),并用LSD方法進行多重比較,顯著性水平設定為α<0.05。

土壤真菌群落結構與土壤理化性質之間的關系采用冗余分析(RDA)方法確定,并采用Monte Carlo置換檢驗計算因子的重要性,其中置換次數設為999次,顯著性水平為P<0.01[21]。

上述統計分析均由R統計平臺實現(R版本3.1.2)。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

與試驗開始前原始土樣相比,0—10 cm土層中各個處理的速效鉀含量提高了3.34—3.53倍,10—20 cm土層中各處理相較原始土樣速效鉀含量提高了2.56—2.76倍,不同處理各個土層中土壤有機碳的含量相較原始土樣也有所下降(表1)。在0—10 cm土層中,純化肥(N300)處理和有機肥配施(OM30)處理較對照(CK)處理速效磷和速效鉀的平均含量有所提高,其中速效磷提高了12.36—17.32 mg/kg,速效鉀提高了7.92—15.75 mg/kg,但無顯著差異(P>0.05)。其他理化因子的變化較小,方差分析也表明,在0—10 cm和10—20 cm土層中,處理間的差異均不顯著(P>0.05)。但兩土層之間比較發現,除全鉀和碳氮比外,0—10 cm土層中的養分含量、pH均顯著高于10—20 cm土層(P<0.05),其中0—10 cm土層中速效磷的含量是10—20 cm土層的5.64—8.27倍。

表1 不同處理及土層之間土壤理化性質

CK：對照,不施氮肥,no N fertilizer；N300：氮肥用量為300 kg/hm2N,chemical N fertilization with 300 kg/hm2N；OM30：70%化肥配施30%有機肥,氮肥用量為300 kg/hm2N,combined 30% organic N fertilizer and 70% inorganic N fertilizer；表中理化數值為平均值±標準誤,P值<0.05表示差異顯著

2.2 土壤真菌群落Alpha多樣性

土壤的Alpha多樣性可以用來表征群落內部的物種多樣性。由表2可知,Coverage值在所有的處理中均大于0.995,表明在該測序深度下,大多數的真菌群落已經被覆蓋。在0—10 cm土層中Observed,Chao1和Shannon指數的范圍分別在1082—1423,1136—1676和4.02—4.64內,在10—20 cm土層中則在472—1145,518—1272和3.45—4.01范圍之內,相同處理中0—10 cm土層的多樣性指數值均顯著高于10—20 cm土層(P<0.05)。

在同層土壤中,多樣性指數的結果均呈CK > N300 > OM30。在0—10 cm土層中,N300與CK處理相比,Observed和Chao1指數均值分別降低了157和219,但二者之間沒有顯著差異(P>0.05)；而OM30與CK處理相比,Observed和Chao1指數均值則降低了269和395,且差異顯著(P<0.05)。在10—20 cm土層中,N300與OM30的Observed指數比CK分別降低了195和342,Chao1指數分別降低了208和377, N300和OM較CK處理Observed指數顯著降低,Chao1指數雖然降低,但N300與CK處理無顯著差,OM30與CK處理相比差異顯著(P<0.05)。

表2 土壤真菌Alpha多樣性指數

不同字母表示統計上有顯著差異,P<0.05

2.3 土壤真菌群落結構

茶園土壤真菌群落中的優勢門類為子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)和擔子菌門(Basidiomycota),三者相對豐度總和達90%以上(圖1)。不同土層間土壤樣品中的真菌群落組成差異顯著,其中子囊菌門在3個處理中均表現為0—10 cm土層相對豐度顯著高于10—20 cm土層(P<0.05),而接合菌門在10—20 cm土層的相對豐度顯著大于0—10 cm土層(P<0.05)。擔子菌門僅在OM30處理中,表現出0—10 cm土層豐度顯著高于10—20 cm土層。亞壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)等其他真菌在土層間無顯著差異(P>0.05)。

圖1 真菌門水平相對豐度圖Fig.1 Relative abundance at phylum levelCK：表示對照,不施氮肥,No N fertilizer；N300：表示氮肥用量為300 kg/hm2 N,Chemical N fertilization with 300 kg/hm2 N；OM30：表示70%化肥配施30%有機肥,氮肥用量為300 kg/hm2 N,combined 30% organic N fertilizer and 70% inorganic N fertilizer

子囊菌門微生物主要是由Sordariomycetes綱、Leotiomycetes綱、Dothideomycetes綱和Eurotiomycetes綱4個綱構成。其中Sordariomycetes綱相對豐度最高(17.62%—23.21%),是優勢綱且在不同處理間差異顯著(P<0.05)(表3)。0—10 cm土層中,Sordariomycetes綱真菌的相對豐度在N300(19.67%)和OM30處理(17.62%)中較CK處理分別降低了3.54%和5.59%；在10—20 cm土層中,CK處理中Sordariomycetes綱相對豐度最高(18.92%),而在N300和OM30處理中,Sordariomycetes綱相對豐度下降到11.93%和10.61%。

擔子菌門微生物由Agaricomycetes綱、Microbotryomycetes綱和Tremellomycetes綱構成,其中Tremellomycetes綱為優勢綱,其相對豐度是Agaricomycetes綱的3.21—5.55倍,是Microbotryomycetes綱的8.47—21.45倍。

接合菌門的微生物主要由Mortierellomycotina綱和Mucoromycotina綱構成,其中Mortierellomycotina綱是優勢種群,其相對豐度是Mucoromycotina綱的10.73—16.96倍,(表3)。在同一土層中,施肥處理顯著增加了Mortierellomycotina綱的相對豐度,在0—10 cm土層中,N300和OM30處理較CK處理分別增加了6.20%和10.20%；在10—20 cm土層中N300和OM30處理較CK處理分別增加了10.20%和9.87%。

表3 各處理真菌綱水平相對豐度/%

不同英文字母表示處理之間有顯著差異，P<0.05

2.4 土壤養分對真菌群落的影響

RDA分析結果顯示,在兩個深度土層中,各處理的真菌群落結構之間差異并不明顯。在0—10 cm土層中,真菌群落差異在兩個排序軸上的解釋率分別是18.85%和14.77%(圖2)。在10—20 cm土層中,RDA1和RDA2兩個排序軸對樣本間真菌群落差異的解釋率分別是17.79%和12.41%(圖2)。置換檢驗的結果顯示,在不同土層中,土壤總有機碳(TC),總氮(TN),碳氮比(C∶N)以及總鉀含量(TK),均為主導真菌群落變化的主要因子(表4)。此外,在10—20 cm土層中,土壤速效鉀含量(AK)對真菌群落的變化具有重要影響(R2=0.69,P=0.008)。

圖2 冗余分析Fig.2 Redundancy Analysis (RDA)AP：速效磷,Available phosphorus；AK：速效鉀,Available potassium；Moisture：含水量；TC：總碳,Total carbon；TN：總氮,Total nitrogen；C∶N：碳氮比,Ratio between total carbon and total nitrogen；TP：全磷,Total phosphorus；TK：全鉀,Total potassium

因子Factors0—10 cm10—20 cmR2PR2P因子Factors0—10 cm10—20 cmR2PR2PAP0.240.2900.080.688TN0.700.002??0.550.037?AK0.040.8450.690.008??C∶N0.810.002??0.670.008??moisture0.380.1040.370.114TP0.160.4580.360.125pH0.220.3310.080.677TK0.800.001???0.720.006??TC0.790.001???0.700.007??

AP：速效磷,Available phosphorus；AK：速效鉀,Available potassium；Moisture：含水量； TC：總碳,Total carbon；TN：總氮,Total nitrogen；C∶N：碳氮比,Ratio between total carbon and total nitrogen；TP：全磷,Total phosphorus；TK：全鉀,Total potassium；P值通過999次置換計算得出,顯著性標記為*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

3 討論

3.1 有機無機配施對土壤理化性質的影響

在福建茶區的定位施肥試驗研究發現有機無機肥配施能顯著增加土壤中養分元素含量,穩定土壤pH,減緩茶園土壤酸化,改良茶園土壤質量[22]。而在本研究中,與CK處理相比,純化肥處理(N300)增加了全氮含量,有機無機配施處理(OM30)增加了土壤有機碳,但并未達到顯著水平(P>0.05)。這可能與試驗地塊的地形有關,由于試驗地區雨熱同期,雨季降水量較大,土壤含水量長期處于飽和水平。根據王云等人的研究,在坡地上,短時間的強降雨極易產生地表徑流,在土壤水分飽和時,即使降雨量少也易產生徑流,造成養分流失[23]。而云南茶區施肥期均處于雨季,盡管采取了開溝施肥措施,但是大的降雨量可能造成坡地茶園中肥料養分的徑流損失,降低了不同施肥處理對土壤理化性質的影響。

3.2 施肥對茶園土壤真菌Alpha多樣性的影響

試驗茶園上下層土壤間的真菌物種多樣性差異顯著,0—10 cm土層土壤的物種總數顯著高于10—20 cm土層,這可能與上層土壤較高的pH和有機碳含量有關。研究發現,土壤pH降低會引起真菌物種總數降低[24]。而有機質含量高的土壤,能為真菌的生長提供良好的環境,有利于真菌物種總數的增加[25]。這與本研究中表層土壤pH、土壤有機碳含量顯著高于下層土壤的結果相一致。

施肥對土壤真菌多樣性的影響并不一致,但是多數研究結果顯示施用無機氮肥或者有機肥配施會降低土壤真菌群落的多樣性[25,26- 27]。施肥導致的真菌多樣性降低可能是由于施肥刺激了某些特定微生物的大量生長,但是抑制其他微生物生長,從而導致多樣性下降[28]。然而也有研究發現長期施無機氮肥或者有機肥配施會增加土壤真菌多樣性[14]。不同的多樣性指數也會得出不同的結論。蔡艷等人研究小麥種植土壤真菌群落時發現,單施化肥或者有機肥配施降低了真菌群落的Shannon指數,但增加了Chao1指數[26]。本研究中與CK處理相比,N300處理的真菌群落的物種總數和多樣性均有所下降,但差異并不顯著,而OM30處理土壤真菌Chao1多樣性指數比CK顯著降低(表2)。張海芳等人對草原土壤的研究顯示,無機氮肥主要是通過影響植物來改變真菌群落結構,而對真菌群落的直接影響較小[29]。但是本研究中有機肥配施并未增加土壤真菌的Chao1指數,這與Chu等人在玉米小麥輪作的砂姜黑土土壤上的研究結果并不一致[14]。但是與丁建莉等在東北黑土長期定位施肥試驗的結果較為一致[30]。對不同生態系統的比較研究發現,茶園土壤中可觀測到的OTU數遠低于其他農田生態系統少[29],與森林生態系統土壤的真菌群落結構較為相近[27]。可以推測,施肥對土壤真菌群落多樣性的影響差異可能與植被類型與土壤性質有關[31]。

3.3 施肥對茶園土壤真菌群落組成的影響

由圖1發現,受測土樣的真菌群落結構主要由子囊菌門、擔子菌門、接合菌門、亞壺菌門以及球囊菌門構成,這與陳丹梅等人在植煙土壤和南方典型水稻土壤的研究結果相一致[25,32]。長期施肥可能會促使土壤中的真菌群落多樣性降低,群落結構主要朝子囊菌,擔子菌和接合菌3個方向演替。本研究中子囊菌門的群落構成與Sun等在不同施肥模式的旱地土壤中的結果相一致,但接合菌門的綱水平組成則有所不同[14]。Sun等的實驗中接合菌門的優勢種群是Microbotryomycetes綱,而本研究中主要以Mortierellomycotina綱和Mucoromycotina綱為主。根據袁賽艷等人采用DGGE技術對茶園土壤真菌群落多樣性的研究,Mortierellomycotina綱和Mucoromycotina綱是茶園土壤真菌的優勢物種[11],表明不同植被覆蓋可能會導致土壤真菌群落組成的差異。

在0—10 cm和10—20 cm土層中,總有機碳、總氮、總鉀含量以及碳氮比是主導茶園土壤真菌群落結構產生變化的主要因子,而速效鉀在10—20 cm土層中也發揮一定的作用,表明不同土層之間的真菌微生物群落結構可能受到土壤理化性質的影響。Zhang 等人在研究高寒地區的土壤真菌群落組成與土壤理化性質的關系時發現,pH是真菌群落組成的最主要因素[33]。但本研究中pH在同一土層的各處理間并無顯著差異,RDA分析和置換檢驗結果也顯示在同一土層中,pH并不是茶園土壤真菌群落結構差異的主控因子,推測茶園土壤本身的酸性較強,配施有機肥對于土壤pH的提升效果不明顯,因此本研究中pH不是造成同層土壤不同處理間真菌群落結構差異的主要原因,推測pH的主控效應可能存在于不同植被覆蓋體系間,而在同一作物土壤中,有機碳,氮以及速效磷才是影響茶園土壤真菌群落組成的主要因素[33]。有研究表明土壤碳氮,速效養分等土壤性質之間存在顯著差異,可能強烈的影響微生物群落結構[34- 35],這與本文中的RDA分析結果相一致。Chu等關于不同土層之間微生物群落結構的變化研究也表明,土層之間微生物群落結構的差異來自于土層之間理化性質的差異,特別是土壤養分狀況的差異[36]。

4 結論

5年不同施肥處理并未顯著改變茶園土壤理化性質,但是不同施肥模式對土壤真菌豐度、多樣性以及菌群組成具有顯著影響。長期施用化學氮肥或有機無機肥配施能夠明顯降低茶園土壤中真菌群落的Alpha多樣性。土壤pH對試驗茶園土壤中真菌群落結構影響不顯著,土壤有機碳、全氮、全鉀、速效鉀是影響茶園土壤真菌群落結構演變的重要因素。