攜IR780碘化物液態氟碳納米粒造影劑的制備及體外雙模態成像

劉明珠，張 萍，2*，王志剛，2，曹 陽，郭 丹，譚米肖，汪星月

(1.重慶市超聲影像學研究所 超聲分子影像學重慶市醫學重點實驗室，重慶 400010；2.重慶醫科大學附屬第二醫院超聲科，重慶 400010)

單一模式成像已不能滿足現代日益增長的多樣化臨床醫學需求，多種影像學技術相結合已成為近年來的研究熱點[1]。作為醫學領域無創成像的新型技術，光聲成像是光學成像和聲學成像的結合，前者利用不同生物介質之間獨特的光譜特性顯示生物組織的分布，后者利用聲波良好的穿透性、指向性、折射及反射等物理特性對病變組織進行顯像[2-4]。可用于光聲成像和傳統超聲成像的雙模態造影劑既可結合傳統超聲成像的高空間分辨力，又可增強組織之間的對比度，具有廣闊應用前景。支持進行光聲成像的材料種類多樣，且敏感性高、特異性強，已得到廣泛應用，特別是在近紅外光區域(700～1 000 nm)有強烈吸收峰的材料，具有良好的光穩定性[5-7]。IR780碘化物是一種七甲川花菁染料，在近紅外區有很強的吸光度值，不溶于水，穩定性好，毒性低，體內循環時間長[8]。支持通過液氣相變進行超聲成像的液態氟碳種類較多，其中沸點相對較低(29℃)的全氟戊烷(perfluoropentane， PFP)更易發生相變，超聲成像效果好[9]。本研究將IR780碘化物聯合PFP包裹于生物相容性的高分子材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物[Poly(lactic-co-glycolic acid)， PLGA]內，構建一種能進行超聲/光聲雙模態成像的納米粒造影劑PLGA-IR780-PFP(IFNPs)，并評估其體外超聲/光聲雙模態成像的效果。

1 材料與方法

1.1主要儀器及試劑 Olympus IX71光學顯微鏡，Nikon AIR激光共聚焦顯微鏡，Zeta SIZER 3000HS馬爾文粒徑分析儀，Hitachi H-7600透射電子顯微鏡，JEOL JEM-7800F掃描電子顯微鏡，SHIMADZU UV-2550紫外分光光度計，Sonics & Materials聲振儀，Mid-River FC-808-2W-MM 808 nm激光儀，Mylab 90超聲診斷儀(LA523線陣探頭，頻率4～10 MHz)，Vevo LAZR光聲成像儀。羥基端乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA-COOH，分子量12 000，聚合比 50∶50)，PFP(Strem Chemicals公司)，IR780碘化物(Sigma公司)，聚乙烯醇(polyvinyl alcohol， PVA；Sigma公司)；二氯甲烷(成都市科隆化學品有限公司)，異丙醇(重慶川東化工有限公司)。

1.2IFNPs的制備 采用雙乳化法，將50 mg PLGA-COOH和2 mg IR780碘化物加入4 ml二氯甲烷(分散相)中，于常溫下震蕩，并置于超聲波清洗儀內充分混勻。在冰浴條件下加入200 μl PFP，聲振3 min(100 W，聲振5 s、停止5 s)，再加入10 ml 4% PVA溶液(連續相)，聲振2 min(60 W，聲振5 s、停止5 s)。將上述溶液加入到10 ml的2%異丙醇溶液內混勻，再轉移至50 ml的燒杯，加磁珠置于磁力攪拌器上攪拌3 h使二氯甲烷充分揮發，經去離子水離心、洗滌3次(8 000 rot/min，8 min)，獲得IFNPs。制備過程全程避光。

1.3IFNPs一般性質檢測 以光學顯微鏡觀察IFNPs大小及分散性；第一次聲振前向混合物中加入少量DiI染液，制備成DiI標記的納米粒(DiI/IFNPs)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察IFNPs的大小及分散性；稀釋IFNPs至1 g/L滴于硅片上，干燥過夜后以掃描電子顯微鏡觀察其表面形態及內部結構；將1 g/L的IFNPs置于銅網上，自然干燥成膜，以透射電子顯微鏡觀察IFNPs的表面形態及內部結構；采用馬爾文粒徑分析儀測量IFNPs大小、分布及電位。

1.4IR780包封率測定 取4 mg IR780溶于二氯甲烷中，配成0.4 g/L標準溶液，再稀釋成不同濃度后，以紫外分光光度計測量其吸光值，取最大吸收峰處的吸光度值繪制成標準曲線；經低溫離心后取IFNPs上清液，以紫外分光光度計測定其吸光值，根據標準曲線計算出上清液中IR780含量，計算包封率，包封率=(IR780投入量-上清液中IR780含量)/IR780投入量×100%。

1.5體外超聲成像 制備IFNPs，配制成濃度為2.5、5.0、10.0、20.0 g/L的溶液(實驗組)，各取200 μl置于96孔板內，以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline， PBS)為對照組，用波長為808 nm能量為2 W/cm2的激光輻照5 min后取出，置于瓊脂糖凝膠模型中，觀察其B模式及造影模式二維灰階超聲圖像。

1.6體外光聲成像 制備IFNPs，配制成濃度為2.5、5.0、10.0、20.0 g/L的溶液(實驗組)，各取200 μl置于瓊脂糖凝膠模型中，以PBS為對照組，于激光激發下采用光聲成像儀(波長700 nm，重復頻率10 Hz，脈沖寬度5 ns，超聲探頭頻率10 MHz)進行光聲信號及二維圖像采集。

1.7統計學分析 采用SPSS 20.0統計分析軟件。首先對計量資料數據進行正態性檢驗，符合正態分布以±s表示，采用單因素方差分析比較不同濃度IFNPs各實驗組及對照組光聲信號值，兩兩比較采用SNK法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1IFNPs一般性質 制備所得IFNPs外觀為綠色混懸液，光學顯微鏡下形態規則，大小均一(圖1A)；激光共聚焦顯微鏡下DiI標記的IFNPs粒徑均一，分散性好(圖1B)；透射電子顯微鏡下表現為外殼黑色、內部灰白色的球形結構(圖1C)；掃描電子顯微鏡由于電壓較高，IFNPs部分發生相變，殘留下來的納米粒呈球形，表面光滑(圖1D)；馬爾文粒徑分析檢測IFNPs的大小為(241.87±3.47)nm(圖1E)，電位為(-0.766±0.096)mV。

2.2IR780的包封率 IR780在波長為780 nm處出現最大吸收峰(圖2)，將波長設定在780 nm，選擇吸光度為0.2～0.8的點繪制標準曲線，計算得出IR780的包封率為(90.38±0.48)%。

2.3體外超聲成像表現 隨IFNPs濃度增加，B模式及造影模式回聲均逐漸增強，對照組PBS的回聲均低于不同濃度IFNPs各實驗組(圖3)。

2.4體外光聲成像表現 光聲成像顯示，隨IFNPs濃度增加，光聲信號逐漸增強(圖4)。濃度為2.5、5.0、10.0、20.0 g/L的IFNPs光聲值分別為0.49±0.02、0.67±0.07、1.05±0.10和1.33±0.05，對照組PBS的光聲值為0.05±0.01，組間差異有統計學意義(F=95.280，P<0.001)，不同濃度IFNPs各實驗組光聲值均高于對照組(P均<0.05)，且各實驗組間兩兩比較差異亦有統計學意義(P均<0.05)。

3 討論

在已有分子影像探針的基礎上，本研究應用生物相容性的PLGA作為殼膜材料，包裹PFP和IR780，利用雙乳化法制備了可進行超聲/光聲雙模態成像的光致相變納米粒造影劑IFNPs。PLGA是美國FDA認證的一類可降解高分子聚合物，生物安全性良好，制備成納米粒之后，由于粒徑較小，比表面積增大，可顯著增加細胞對其的攝取，同時保證納米粒在體內不會對正常組織造成損害。作為一種近紅外染料，IFNPs內部的IR780化學結構中包含1個剛性的聚乙烯基環，中間有1個氯原子，有強烈的疏水性，由于其對有機陰離子轉運多肽(organic anion transporting polypeptides， OATPs)的親和力，使IR780在腫瘤區域大量積聚，對腫瘤的診療有巨大優勢[8,10-11]；將其包載進IFNPs后可增加水溶性，進一步促進其在體內發揮作用。有研究[12]將IR780包裹在人血清白蛋白內形成納米粒，用于對腫瘤進行光熱及光動力治療，體外和體內實驗均證實此種納米粒既可產生過高熱又可產生活性氧，能夠顯著抑制小鼠結腸癌CT26細胞的生長。少量的IR780安全性很高，在1～2天內即可自循環系統中完全清除，而不被肝脾網狀內皮系統吞噬[13]。作為IFNPs內核的液態PFP在常溫下為液態，受激光觸發后變為氣態，逐漸膨脹直至納米粒破裂，無需生物降解。因此，將IR780和PFP包裹進PLGA內制備成的納米粒生物安全性極高，且所制備的IFNPs在常溫下可放置1周、4℃下可放置1個月，穩定性好，有望作為一種雙模態造影劑應用于臨床。

圖1 IFNPs一般性質 A.光學顯微鏡下表現(×400)； B.激光共聚焦顯微鏡下表現(×400)； C.透射電子顯微鏡下表現(×20 000)； D.掃描電子顯微鏡下表現(×5 000)； E.粒徑分布圖 圖2 IR780紫外可見光吸收光譜圖

圖3 對照組(PBS)及不同濃度(2.5、5.0、10.0、20.0 g/L)IFNPs各實驗組B模式(A～E)及造影模式(F～J)聲像圖

圖4 對照組(PBS，A)及不同濃度(2.5、5.0、10.0、20.0 g/L)IFNPs各實驗組(B～E)體外光聲成像圖

本研究對IFNPs進行物理性質檢測，發現納米粒呈綠色，顏色均勻，未見游離相。IFNPs在光學顯微鏡、共聚焦顯微鏡、掃描電子顯微鏡下呈球形，外表光滑，大小均一，粒徑較小，且分散性好；透射電子顯微鏡下呈現外殼黑色而中間灰白色的球形結構，這是由于IR780與PFP的電子密度不同所致。IFNPs的粒徑為(241.87±3.47)nm。一項有關嚙齒類動物的研究[14]表明，腫瘤微血管孔徑為100～780 nm，而大部分正常組織(腎臟、肝臟和脾臟除外)微血管內皮細胞間的緊密連接空隙<2 nm。本實驗制備的納米粒能夠通過腫瘤微血管進入腫瘤，而不易進入正常組織間隙。體外二維灰階超聲成像顯示，隨納米粒濃度增加，B模式和造影模式下的回聲均逐漸增強，而對照組未顯影，表明IFNPs成功包載了PFP。在808 nm波長的激光輻照下，IR780良好的光熱性能使其內部包裹的PFP發生液氣相變，從而增強了B模式和造影模式下的成像效果。納米粒在780 nm處有強烈的吸收峰，且IR780的包封率非常高，因此在近紅外激光的觸發下，隨IFNPs濃度增加，光聲信號逐漸增強，而對照組未顯影，進一步證實了IR780被成功包裹進入IFNPs。

綜上所述，本實驗通過雙乳化法成功制備了包裹IR780的液態氟碳納米粒IFNPs，且其形態規則，大小均一，分散性好，在體外瓊脂糖凝膠模型中對超聲/光聲雙模態顯影效果均非常明顯，表明此納米粒具有超聲/光聲雙模態成像的效果。本研究的主要局限性在于IFNPs未連接可主動靶向至腫瘤的配體，只能通過被動靶向(增強滲透滯留效應)聚集到腫瘤。未來在用于體內時，應將IFNPs與特異性靶向配體連接，以提高納米粒主動靶向到腫瘤的能力，以期實現對腫瘤的可視化治療。