鉛暴露時間對大腦皮質ATG5、Beclin1、LC3B表達的影響

盧北玲，史劍飛，周軍

（1.陜西省西安市中醫醫院 檢驗科，陜西 西安 710001；2.陜西省西安市兒童醫院 檢驗科，陜西 西安 710003；3.中南大學湘雅醫院 醫學科學研究中心，湖南 長沙 410008）

鉛是廣泛存在于自然界的一種重金屬，對中樞神經系統的損害是不可逆的[1]。鉛暴露造成幼腦學習能力下降，但卻鮮有文獻解釋成年人在鉛暴露環境下的變化，以及不同時間的鉛暴露對大腦功能的影響是否一致。文獻報道主要集中在鉛對腦海馬區的損傷，很少對腦皮質功能的改變進行研究[1-3]。本實驗將豚鼠在含鉛環境暴露不同時間后，對皮質表達的自噬蛋白進行分析，為早期預防鉛暴露危害提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年豚鼠，雌雄不限，體重400～500 g，SPF清潔級，由中南大學實驗動物學部提供。全部實驗動物在適應性飼養5～7 d后用于實驗，分籠飼養，12 h晝/夜循環照明，自由飲食和飲水，室溫（20±2）℃。

1.2 主要儀器與試劑

0.2%醋酸鉛溶液（上海碧云天生物公司），ATG5（NB100-53818）、Beclin1（NBP1-00085）、LC3B（NB100-2220）購自美國Novus公司，多功能酶標儀（M200pro，奧地利Tecan 公司），石蠟包埋機（EG1150）、倒置顯微鏡（DM2000）購自德國Leica公司。

1.3 實驗動物分組與處理

18只成年豚鼠隨機分為4組：對照組（3只），以及鉛暴露15、60和90 d組（每組5只）。對照組給予等量的生理鹽水，鉛暴露組用0.2%醋酸鉛飲用水喂養豚鼠。喂養不同時間后對動物進行麻醉，斷頭取腦，立即放入4%多聚甲醛溶液中進行固定、脫水、石蠟包埋、切片。

1.4 免疫組織化學法

石蠟切片在烤箱烤干后，進行脫蠟及水化，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline, PBS）浸泡切片2、3次，5～10 min/次，用3% GS或10% HS封閉40 min，PBS洗3次，加入抗ATG5（1∶500）、Beclin1（1∶500）、LC3B（1∶500）4℃孵育過夜，次日用PBS洗3次，10 min/次，加入相對應的二抗（1∶400）室溫孵育2 h，PBS洗3次，用DAB進行顯色。在顯微鏡下觀察，直到出現滿意的顏色，脫水、封片、晾干后用普通倒置顯微鏡對大腦皮質區（根據海馬區情況進行皮質區的視野選取，在拍照過程中選取海馬周邊的皮質區進行拍照，每張片子保持一樣的腦皮質位置）進行拍片統計（不連續的3～5個視野）。

1.5 統計學方法

數據分析采用Graphpad prism 6.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同時間鉛暴露后豚鼠腦皮質區ATG5的陽性表達比較

ATG5陽性表達在細胞質或細胞膜。對照組，以及鉛暴露15、60和90 d組的ATG5陽性細胞數分別為（87.08±53.27）、（86.38±48.18）、（93.77±43.45）和（152.08±44.32）個/HP，經方差分析，差異有統計學意義（F=6.643；P=0.005）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，鉛暴露90 d組高于對照組（P＜0.05）；對照組與其余各組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果表明，不同時間鉛暴露后，ATG5有不同程度的升高，但鉛暴露90 d組升高最明顯，推測ATG5在鉛暴露后早期可能起保護大腦組織的作用，而隨著鉛暴露時間的延長，ATG5蛋白表達更加明顯，引起腦神經細胞的損傷。見圖1、2。

2.2 不同時間鉛暴露對豚鼠大腦皮質Beclin 1蛋白表達的影響

Beclin 1蛋白定位在神經元胞質或細胞膜。對照組，以及鉛暴露15、60和90 d組的Beclin 1陽性細 胞 數 分 別 為（32.00±23.89）、（108.31±35.25）、（123.85±33.82）和（126.62±26.77）個/HP，經方差分析，差異有統計學意義（F=25.910；P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，對照組與其他組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；鉛暴露15、60和90 d組組間兩兩比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。但是隨著鉛暴露時間延長，Beclin1陽性細胞數也升高，可見隨著鉛暴露時間延長，自噬蛋白Beclin1的表達升高。見圖3、4。

圖1 各組豚鼠腦皮質區ATG5的表達 （免疫組織化學法×200）

圖2 各組豚鼠ATG5陽性細胞數比較 （±s）

2.3 慢性鉛暴露下豚鼠大腦皮質LC3B的表達變化

腦皮質區自噬蛋白LC3B主要表達在細胞膜，陽性細胞呈現棕黃色。對照組，以及鉛暴露15、60和90 d組的LC3B陽性細胞數分別為（59.38±12.18）、（103.46±33.96）、（107.38±70.27）和（118.08±38.91）個/HP，經方差分析，差異有統計學意義（F=7.575；P=0.002）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，對照組與其他組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；鉛暴露15、60和90 d組組間兩兩比較，差異無統計學意義（P＞0.05），結果提示，鉛飲用水可引起大腦皮質區LC3B升高。LC3B陽性表達與Beclin1的變化趨勢一致。見圖5、6。

圖3 各組豚鼠腦皮質區Beclin1的表達 （免疫組織化學法×200）

圖4 各組豚鼠Beclin1陽性細胞數比較 （±s）

圖5 各組豚鼠腦皮質區LC3B的表達 （免疫組織化學法×200）

圖6 各組豚鼠LC3B陽性細胞數比較 （±s）

3 討論

人類鉛暴露通常來自于水、空氣及土壤污染，長期處在高鉛環境中將會損害大腦發育，包括細胞增殖等，但是其具體作用機制并不清楚，仍然是亟待解決的健康問題[2]。鉛具有很強的親組織性和神經毒性，且血鉛濃度升高是導致神經不可修復，以及兒童生理和行為障礙的關鍵原因。自噬水平升高可能是一種代償性的保護效應，但在自噬反應超過某一閾值，表現為過度激活的情況下，會進一步損傷細胞器并促發自噬性細胞死亡[3]。自噬是真核細胞中廣泛存在的降解系統，在自噬過程中，大部分胞質蛋白和損害的細胞器通過溶酶體聚集和降解，但是對應激和損傷的過度自噬反應會導致自噬性細胞死亡，說明自噬在組織細胞清除中起雙刃劍的作用[4]。有研究指出，自噬是細胞死亡的誘發因素[5]。暴露于鉛環境的動物與人腦組織中均可觀察到老年斑和神經纖維纏結[6]。重金屬鉛仍是構成環境有毒物質的危險因素，但是沒有研究指出鉛是阿爾茨海默病或Tau蛋白形成的誘因。對年齡＞65歲老人進行橫向研究發現，血液中高水平鉛組認知能力明顯下降[7]。鉛很容易通過胎盤屏障，尤其是鼠受孕期處于鉛暴露環境中，會對子鼠的行為學發育造成不可逆的損害；在鉛暴露停止后，這些行為學改變會繼續持續很長時間，還可引起膽堿能系統的改變[8]。妊娠期或哺乳期接觸鉛會引起胎兒神經元氧化應激，導致大腦認知相關蛋白水平改變，且胎兒大腦發育過程中對毒性鉛有易感性，導致新生的神經元增殖或神經元突觸連接發生中斷[9]。Beclin1可能在自噬和凋亡2種程序性細胞死亡中發揮調節作用[10]。

本實驗中，豚鼠在不同時間鉛暴露后ATG5、Beclin1和LC3B的表達水平較對照組升高，進一步說明大腦組織中自噬相關蛋白對神經元起調節作用。鐵可降低動物血液和腦組織的鉛濃度，在一定程度下對大腦具有保護性效應，可能是因為鉛鐵離子傾向于引起氧化性效應而不是神經中和效應[11]。在發育時期鉛暴露可降低突觸的可塑性，造成認知功能和行為學紊亂，這是早期生命鉛暴露導致的最常見的效應，且鉛暴露效應對負責空間記憶和理解的大腦海馬區更易產生影響[12]。鉛可促進原代大鼠近端腎小管細胞（proximal tubular, PT）中自噬溶酶體的聚集，且自噬蛋白的增多和溶酶體膜透化對腎小管細胞的凋亡抑制作用促進了鉛的腎小管毒性[13]。自噬和細胞凋亡是細胞發展的2種結果，鉛抑制PT細胞自噬的降解，然而自噬降解抑制劑加重鉛誘導的細胞凋亡，自噬與凋亡的相互聯系有助于進一步了解鉛誘導的腎毒性的具體機制[14]。

在鉛暴露環境中，女性更容易患阿爾茨海默癥，所以需要進一步探索鉛暴露對胚胎期小鼠引發的危險[15]。神經干細胞在大腦發育過程中扮演重要角色，鉛可以阻斷其功能，可能是鉛誘導紅系衍生的核轉錄因子2誘導依賴的轉錄性反應，導致分泌型磷蛋白1的上調[16]。自噬參與自噬溶酶體的形成，而且自噬溶酶體已經被廣泛用于Caspase非依賴的細胞死亡通路，與大腦缺血再灌注損傷有關，而且干擾RNA介導的Beclin1表達下降減弱了大鼠的腦缺血損傷，這可能與

降低凋亡，促進神經再生有關，因此Beclin1的降低有助于改善中風患者的病情[17]。有研究證明，鉛可能會損害人和動物的免疫系統，鉛可誘導細胞氧化性應激，影響線粒體的動態平衡和自噬反應的發生，導致脾臟的免疫紊亂[18]。還有研究證實，在代謝應激的情況下，ATG7通過調節p53的活性來調節細胞周期和細胞活性[19]。但也有研究指出，大腦海馬和皮質區的自噬標志物表達有明顯區別，在氧糖剝得模型誘導后的早期，皮質區出現自噬反應但海馬區無，且自噬抑制劑的使用阻斷其誘發的谷氨酸釋放效應[20]。本實驗選取不同時間鉛暴露后豚鼠的大腦皮質區，進一步探討環境鉛對成年鼠引發的自噬反應，對鉛接觸的早期預防提供實驗依據。