LKB1在鼻咽癌中的表達及與化療敏感性的關系*

張旭戈，周珊，傅少志，苗洪賓，劉彥婷，覃綱

（西南醫科大學附屬醫院1.耳鼻咽喉頭頸外科，2.腫瘤科，四川 瀘州 646000）

多重耐藥嚴重影響鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）患者的預后，尋找提高NPC化療敏感性的靶點可能是提高其療效的突破點。近年來，有文獻報道肝激酶B1（liver kinase B1, LKB1）在肺癌等多種惡性腫瘤中突變或缺失，參與腫瘤的發生、發展及侵襲轉移[1]，且其下游靶點腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）的激活可增加化療藥物的敏感性[2]，而LKB1在NPC組織中的表達及與化療的研究則鮮有報道。本課題通過檢測NPC組織中LKB1的表達水平，分析其與患者臨床病理因素、預后及化療敏感性的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年3月—2016年8月在西南醫科大學附屬醫院首次經組織活檢確診并治療的NPC患者74例，收集各例患者的新鮮活檢腫瘤組織和腫瘤組織石蠟塊。其中，男性52例，女性22例；年齡21～77歲，中位年齡49歲。病理組織學分型：角化性鱗狀細胞癌5例，非角化分化型癌31例，非角化未分化型癌38例。按照國際抗癌聯盟（UICC）和美國癌癥分期聯合委員會（AJCC）第7版（2010）方案進行NPC的TNM分期，臨床分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期9例，Ⅲ期48例，Ⅳ期14例。

1.1.1 納入標準 ①所有患者術前未行放化療，首次經本院病理科確診為NPC并治療；②未合并其他惡性腫瘤，具備完整的臨床及病理資料；③石蠟切片質量佳，隨訪資料完整。本課題經本院醫學倫理委員會批準，所有患者在術前簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人LKB1多克隆抗體（abs124916a，上海Absin生物科技有限公司），Envision免疫組織化學法檢測試劑（K5007，丹麥Dako公司），氟尿嘧啶、奧沙利鉑及環磷酰胺購自連云港市恒瑞醫藥公司，順鉑和卡鉑購自濟南市齊魯制藥有限公司，紫杉醇（北京協和藥廠），多西他賽和吉西他濱購自連云港市豪森藥業股份有限公司，ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術（ATP-TCA）試劑盒（北京金紫晶生物醫藥技術有限公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；微孔板發光儀（北京濱松光子技術有限公司）。

1.3 免疫組織化學Envision二步法

取組織石蠟塊，3μm厚切片，常規脫蠟，依次在EDTA修復液（pH=9.0）、檸檬酸鹽修復液（pH=6.0）中高壓抗原修復，3%甲醇H2O2去除內源性過氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline,PBS）沖洗。依次滴加用PBS稀釋為1∶200的兔抗人LKB1多克隆抗體，37℃孵育1 h；PBS沖洗，滴加二抗，37℃孵育30 min；PBS沖洗，DAB顯色，自來水沖洗終止顯色；流水沖洗，蘇木精復染。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

LKB1染色為黃色或者棕黃色，所有切片在同一顯微鏡200倍視野下調整相同曝光強度、關閉自動白平衡功能，只調整焦距和視野，隨機選取5個視野拍照；將Image Pro Plusversion 6.0（IPP）專業圖像分析軟件的灰度單位轉換成光密度單位，測量切片的面積（area）、累積光密度 （integrated optical density, IOD），計算平均光密度值（mean optical density, MOD），進行半定量統計分析。MOD=總IOD/總area。

NPC中LKB1高、低表達分組：以所測NPC的MOD中位數為界限，小于中位數為低表達，大于或等于中位數為高表達。

1.4 化療藥物敏感實驗

嚴格按照ATP-TCA試劑盒說明書進行操作。取部分新鮮活檢標本消化重懸成單細胞懸液，調整密度為 2×105～ 4×105/ml，取100μl接種于 96孔培養板，加入抗腫瘤藥物（實驗組），每種藥物設置5個測試濃度：200.0%、100.0%、50.0%、25.0%和12.5%PPC。PPC為根據待測藥物的臨床使用劑量所對應的血漿峰值濃度（peak plasma concentration, PPC）。2個對照組：不加任何抗腫瘤藥物的對照組（M0）、加入最大ATP抑制劑的對照組（M1），將各組培養板置于37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養4～6 d，加入50μl/孔 ATP提取液，吹打混勻，再取50μl混合上清液置于對應的微孔板內，最后加入50μl/孔發光工作液，震蕩檢測。

1.4.1 評價標準 強敏感（SS）：IC50≤25% PPC和IC90≤100% PPC；中度敏感（IS）：IC50≤25%PPC 和 IC90＞100% PPC；輕度敏感（MS）：IC50＞25%PPC和IC90≤100% PPC；耐藥R：IC50＞25% PPC和IC90＞100% PPC。IC50、IC90分別為抑制 50% 腫瘤細胞生長時的血漿峰值濃度和抑制90%腫瘤細胞生長時的血漿峰值濃度[3]。

1.5 隨訪

所有患者以門診復查或回訪電話的方式進行隨訪，隨訪截止時間2017年11月30日。無進展生存期為患者從確診NPC后首次住院至確診腫瘤進展、患者死亡或末次隨訪時的總時間。總生存期為患者從首次住院確診為NPC至任何原因引起的死亡或末次隨訪的總時間。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計數資料以構成比（%）表示，比較用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NPC組織中LKB1的表達

免疫組織化學法結果顯示，在LKB1高表達的NPC組織中，LKB1蛋白在細胞核和細胞質中均有表達，呈棕黃色（見圖1）。半定量統計分析結果表明，74例NPC患者中，LKB1蛋白的MOD中位數為0.146，LKB1低表達組與LKB1高表達組MOD比較，經獨立樣本t檢驗，差異有統計學意義（t=10.180，P=0.000），LKB1 低表達組 MOD（0.122±0.019）低于LKB1高表達組的MOD（0.165±0.017）。見圖2。

2.2 NPC患者LKB1表達水平與臨床病理因素的關系

74例NPC組織中，LKB1高、低表達組患者性別、年齡、病理類型、T分期、N分期、M分期和臨床分期比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）。兩組患者性別比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）。見附表。

圖1 LKB1在NPC組織中的表達 （Envision二步法）

圖2 NPC組織中不同LKB1表達組的MOD比較 （±s）

2.3 NPC組織對化療藥物的敏感性

74例NPC組織對氟尿嘧啶、奧沙利鉑、卡鉑、紫杉醇、環磷酰胺、吉西他濱、順鉑和多西他賽8種化療藥物的敏感性比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=47.226，P=0.000），NPC組織對卡鉑的敏感性最高。見圖3。

2.4 NPC組織LKB1表達水平與化療藥物耐藥率的關系

LKB1低表達組與LKB1高表達組的環磷酰胺耐藥率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=6.186，P=0.013），LKB1低表達組高于LKB1高表達組。其余7種化療藥物的耐藥率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 4。

附表 NPC患者LKB1表達水平與臨床病理因素的關系 [n =37，例（%）]

圖3 NPC組織對化療藥物的敏感性比較

圖4 NPC組織LKB1表達水平與化療藥物耐藥率的關系

2.5 NPC組織LKB1表達水平與預后的關系

LKB1低表達組患者的轉移和復發率（45.95%）與高表達組（40.54%）比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義（χ2=0.220，P=0.639）（見圖 5）。LKB1低表達組的死亡率為40.54%，LKB1高表達組為18.92%，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=4.140，P=0.042），LKB1低表達組高于高表達組（見圖6）。

圖5 兩組患者的轉移和復發率比較 （±s）

圖6 兩組患者的死亡率比較 （±s）

LKB1低表達組患者的無進展生存率與高表達組比較，經Log-rank χ2檢驗，差異無統計學意義（χ2=1.644，P=0.200）（見圖7）。兩組患者的總生存率比較，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=5.385，P=0.020），LKB1低表達組低于高表達組（見圖8）。

圖7 兩組患者的無進展生存率比較 （±s）

圖8 兩組患者的總生存率比較 （±s）

3 討論

NPC是我國常見的頭頸部惡性腫瘤之一，惡性程度高，早期易發生淋巴結轉移。目前采用以放療為主的綜合治療，放化療與單純放療后的5年生存率分別為95%和86%[4-6]，故放化療在多數治療中可取得較好的療效，并逐漸成為主要治療方案[5]。但仍然存在治療失敗，其中對化療藥物的耐藥是治療失敗的重要原因之一。因此，尋找增加化療敏感性的標志物，對提高NPC的預后有重要的意義。

LKB1基因為一種抑癌基因，通過原位雜交技術檢測發現幾乎在人體的所有組織中有LKB1 mRNA的表達[6]。近年研究表明，LKB1在多種惡性腫瘤中存在缺失或突變，參與多種腫瘤的發生、發展及轉歸。LKB1/AMPK信號通路能調控腫瘤細胞的G1期，阻滯細胞周期，影響腫瘤細胞的生長[7]。有學者證實，激活AMPK的表達能夠提高膀胱癌對化療藥物的敏感性[8]。在非小細胞肺癌中，LKB1通過下調mTOR等的表達，增加對化療藥物順鉑的敏感性[9]。與此類似，LKB1可促進卵巢癌細胞SIK1表達，明顯抑制其細胞的生長、侵襲，促進細胞的凋亡。進一步研究發現，采用siRNA干擾技術敲除卵巢癌細胞中LKB1表達，能提高轉化生長因子-β和EMT的表達，進一步降低卵巢癌細胞對化療的敏感性；同樣，構建重組質粒使LKB1過表達，能增加化療敏感性，顯著地抑制細胞的侵襲和轉移[10]。然而，LKB1在NPC組織中的表達及與化療敏感性關系的研究則鮮有報道。

本實驗通過免疫組織化學法對74例NPC組織中LKB1的表達進行檢測，發現LKB1蛋白在細胞核和細胞質中均有表達，LKB1高、低表達組間性別比較有差異，而兩組其他臨床因素比較無差異；LKB1低表達組的死亡率高于高表達組，LKB1低表達組的總生存率低于高表達組，但兩組患者腫瘤復發和轉移率、無進展生存率無差異。該結果與唐亮等[11]的研究不完全一致，可能是因為選擇NPC標本的差異及隨訪時間不同等。本實驗主要研究LKB1在NPC組織中高、低兩組表達的情況，以及與臨床因素、化療藥物敏感性及預后的關系。程忠強等[12]的研究證明，鼻咽黏膜慢性炎癥組織中LKB1的表達水平高于NPC組織，所以本實驗未選取鼻咽黏膜慢性炎癥組織作為對照組。

本實驗發現，74例NPC組織細胞對臨床上常用的8種化療藥物（氟尿嘧啶、奧沙利鉑、卡鉑、紫杉醇、環磷酰胺、吉西他濱、順鉑和多西他賽）均敏感，其中對鉑類化療藥物最敏感，與2017年NCCN指南中放化療方案中常用鉑類藥物對應[13]。進一步將研究的NPC組織分成LKB1高、低表達組，比較兩組間8種化療藥物敏感性的差異，發現LKB1表達差異只與環磷酰胺敏感性有關，與余下7種化療藥物無關，并且與LKB1高表達NPC患者比較，LKB1低表達NPC患者死亡率增加，總生存率降低，可能與LKB1調控及抑制化療藥物的敏感性有關。環磷酰胺是烷化劑類中的一種細胞周期非特異性抗腫瘤藥物，不僅能作用于腫瘤細胞周期，調控細胞的凋亡，而且還能通過下調VEGF，參與抗血管生成的作用[14-15]。LKB1可通過激活AMPK，下調mTOR表達，抑制腫瘤細胞的增殖和生長[16]。而CEJKA等[17]研究發現，采用mTOR抑制劑依維莫司,可以增加化療藥物烷化劑環磷酰胺的敏感性。因此，推測低表達LKB1可能通過抑制AMPK/mTOR信號通路導致NPC對環磷酰胺耐藥。LKB1能否作為臨床上NPC患者提高環磷酰胺治療敏感性的分子靶點及其具體機制，尚待進一步研究。

本實驗通過檢測LKB1蛋白在NPC中的表達，分析LKB1表達與NPC患者臨床病理因素、化療敏感性及預后的關系，初步證實LKB1在NPC中的低表達降低了患者總生存率，并導致對環磷酰胺耐藥，但具體調節的機制有待進一步研究。