經共表達網絡初探介入治療后心房顫動的作用機制

吳曉峰

（青海省心腦血管病專科醫院 心內科，青海 西寧 810000）

目前，冠狀動脈（以下簡稱冠脈）疾病患者在介入治療時常伴有心律失常等不良反應。其中，心房顫動（atrial fibrillation, AF）是最常見的持續性心律失常，普通人群患病率為1%～2%[1-2]。AF患者的卒中風險較正常人群增加5倍，AF引起的缺血性卒中可能致命[3-6]。本研究將冠脈介入治療后發生/未發生AF患者各4例進行轉錄組測序，分析這些樣本差異表達的樞紐基因與臨床表型（如AF等）之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月—2017年5月青海省心腦血管病專科醫院收治的AF患者14例作為AF組，選取同期醫院收治的冠脈介入治療后未發生AF患者14例作為非AF組。兩組各4例患者的左心房組織用于轉錄組測序，各10例患者的左心房組織用于基因表達的驗證實驗。在轉錄測序患者中，房顫組男性3例，女性1例；平均年齡（62.5±3.7）歲；高血壓3例；非房顫組男性2例，女性2例；平均年齡（59.2±3.9）歲；高血壓1例。AF組與非AF組患者的一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會的審批同意，患者均在知情同意書上簽字。

1.2 方法

1.2.1 高通量測序 深圳華大基因生物信息科技有限公司通過HiSeq 2000測序儀（美國Illumina公司）完成了本研究的轉錄組測序（RNA sequencing, RNASeq）工作。

1.2.2 測序數據的前處理 利用TopHat v2.01軟件，比較參考基因和測序數據，通常狀況下序列的比對率要求＞90%[7]。以每百萬讀段的堿基片段（fragments per kilo bases per million reads, FPKM）評估基因表達的水平[8]。

1.2.3 差異基因表達分析 首先將冠脈介入治療后兩組患者左心房組織的基因表達水平進行比較，應用Cufflinks v2.2.1軟件挖掘出錯誤發現率（the false discovery rate, FDR）＜0.05的差異表達基因，每個差異表達基因經校正后的顯著性=差異基因的P值×基因總數/最大P值對應的排序號[9]。

1.2.4 加權基因共表達網絡（weighted gene co-expression network, WGCN）分析 運用WGCN來分析差異表達基因[10]。本研究提到的共表達網絡的定義為：1個基因由1個節點代表，在相同的基因網絡中，不同樣本有共性表達，通過其相關表達系數來衡量基因之間的共表達關系。①WGCN的建立：連接相關基因時，選擇權重的標準為p（i）～i-r，即連接數為i的概率p（i）與i的n次方成反比，并且服從無尺度網絡分布。對加權系數進行選擇，進而實現應用過程中無尺度網絡分布。同時滿足以下條件：如果模塊不同，其中的基因平均連接度就高，這個節點產生概率的對數值[log p（i）]和連接點個數的對數值[log（i）]呈負相關。②WGCN構建的方法：冪指數鄰接函數被應用于WGCN算法。應用鄰接系數αmn這個指標可以衡量任何基因對的相關性，也就是針對相關系數進行次方的冪指數加權：αmn=power（Smnβ）=|Smn|β。確定加權系數β要嚴格遵守無尺度網絡原則，指連接節點個數取對數[log（k）]與節點出現的概率的對數值[log p（k）]之間相關系數與0.8非常接近。把鄰接函數參數β確定好以后，隨后轉換相關矩陣S=|Smn|。③基因集模塊與表型信息的關聯：計算得到基因模塊特征值，再計算模塊的特征向量與關注表型的相關系數；對于分組表型數據（如疾病狀態等），可以首先定義用t-test計算每個基因在不同組（如疾病組和正常組）間基因比較有差異的P值，并將P值以10為底的對數值定義為基因顯著性，再將模塊內所有基因顯著性值取平均數，該數值即為模塊的顯著性（module significant，MS）。MS值越高說明這個模塊與疾病之間的關聯越高。④基因的顯著性也可以定義為某個基因表達譜與表型信息的相關性。

1.3 qRT-PCR檢測樞紐基因的表達

用Trizol試劑裂解組織，提取總mRNA，使用日本TOYOBO公司的逆轉錄試劑盒，按說明書操作，逆轉錄得到cDNA后，進行qRT-PCR擴增檢測，ABI7300設置條件為：95℃預變性3 min，95℃變性2 s，60℃延伸30 s，反應40個循環后擴增終止。

1.4 統計學方法

數據分析采用R 2.39統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，相關分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者差異表達基因分布

兩組患者左心房組織的比較中展示了差異表達基因FPKM層次聚類圖的分布情況，聚類方式選用歐氏距離法（見圖1）。本研究一共識別了824個差異表達基因，其中上調基因314個，下調基因510個。

2.2 基因模塊的識別

通過動態剪切樹法，本研究將824個差異表達基因用于WGCN分析，共識別18個基因模塊。對每個基因模塊的特征向量基因相似度進行分析，最終得到了8個相似度較高的模塊（見圖2）。

圖1 兩組患者差異表達基因分布

圖2 基因模塊的識別

2.3 各基因模塊與臨床表型的相關性

紫色模塊與AF嚴重程度具有相關性（r=0.990，P=0.005）。見圖 3。

2.4 樞紐基因與AF嚴重程度的相關性

RCAN1和DNAJA4基因在紫色模塊中對AF的作用最強（均q=0.038）。見附表。

2.5 兩組患者RCAN1和DNAJA4基因相對表達量比較

AF組RCAN1基因相對表達量為（9.213±2.132），非AF組為（4.891±2.215），經t檢驗，差異有統計學意義（t=28.756，P=0.000），AF組高于未AF組。AF組DNAJA4基因相對表達量為（0.983±0.321），非 AF 組為（5.263±0.538），經t檢驗，差異有統計學意義（t=30.756，P=0.000），AF組低于未AF組。見圖4。

圖3 各基因模塊與臨床信息的相關性

附表 樞紐基因與AF嚴重程度的相關性參數

圖4 兩組患者RCAN1和DNAJA4基因表達量比較（n =4，±s）

3 討論

隨著高通量技術的快速發展及其在復雜性疾病研究中的廣泛應用，為研究疾病的發病機制奠定了基礎[11-14]。本研究對10例冠脈介入治療后發生AF患者以及10例冠脈介入治療后未發生AF患者的左心房組織進行RNA-Seq測序，并根據差異基因表達譜鑒定出與臨床表型相關的基因集模塊，發現兩個樞紐基因（RCAN1和DNAJA4）的表達變化與AF嚴重程度顯著相關。

之前有研究表明鈣調神經磷酸酶是一種細胞質Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白磷酸酶，通過與NFAT和L型Ca2+通道的相互作用刺激心臟肥大[15-16]。已知RCAN1可抑制鈣調神經磷酸酶及其相關途徑[17]。但有學者表明，當高度表達并且因此增強肥大信號傳導時，RCAN1可以替代地用作鈣調神經磷酸酶激活劑[18]。因此，RCAN1水平的攝動（歸因于遺傳變異或突變）可能導致功能異常轉換，從而觸發心房重構和心律失常發生。DNAJA4調節KCNH2鉀通道的運輸和成熟，其在心臟復極化中具有重要作用，且涉及長QT綜合征[19]。FHL2與許多細胞組分相互作用，包括肌動蛋白細胞骨架，轉錄機制和離子通道[20]。FHL2顯示增強異丙腎上腺素的肥大作用，表明FHL2可能調節環境應激對心肌細胞生長的影響。FHL2還與心臟中的幾種鉀通道如KCNQ1、KCNE1和KCNA5相互作用[21]。此外，血管心外膜物質（blood vessel epicardial substance, BVES）和其家族其他成員被證明在心臟起搏細胞中高度表達。BVES敲除小鼠顯示竇性結節功能障礙，表明BVES調節心臟起搏和傳導系統的發展，因此可能參與AF的早期發展階段[22]。

本研究的幾個缺陷：首先，沒有足夠大的人類左心房mRNA數據集存在。因此，本研究使用獨立的數據集通過PCR方法驗證RNA-Seq分析的結果，結果表明本研究識別的樞紐基因是可靠的。其次，缺少基因功能性試驗，在后續的研究將深入探究該樞紐基因的功能驗證。

總之，本研究運用了新技術RNA-Seq對有無AF發生的左心房組織的差異表達基因進行了WGCN分析，初步定位出冠脈介入治療后與AF有關的樞紐基因為RCAN1和DNAJA4。后續將對上述基因實施體內外功能驗證，進一步闡明冠脈介入治療后與AF發生的機制并制定防治手段。