血清Dickkopf-1蛋白在早期診斷股骨頭壞死及病情監測中的意義*

李偉峰 ，陳立新 ，陳嘵俊 ，龔水帝 ，龐鳳祥 ，何曉銘 ，沈瑩姍 ，楊帆 ，楊鵬 ，何偉，魏秋實，陳鎮秋

（1.廣州中醫藥大學 第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院 三骨科，廣東 廣州 510405；3.廣州中醫藥大學第一附屬醫院 三骨科保髖區，廣東 廣州 510405）

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head,ONFH）是由多種病因造成的股骨頭血液供應不足或中斷，引起骨細胞漸進性凋亡，繼而導致股骨頭關節面塌陷的骨科疑難疾病，好發于20～40歲青壯年[1-2]。有研究表明骨重塑失衡和骨細胞凋亡是其病理改變過程中的重要環節[3-4]。Dickkopf-1（DKK-1）是Wnt信號通路拮抗劑，可抑制成骨細胞分化，促進成骨細胞凋亡，同時可刺激破骨細胞生成，是骨量的關鍵調節因子[5-6]。因此，在ONFH病情進展中，骨重塑失衡與骨細胞凋亡增加，可能伴隨著血清DKK-1蛋白濃度升高。本研究旨在探討血清DKK-1蛋白與ONFH病情進展的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月—2016年11月于廣州中醫藥大學第一附屬醫院住院的ONFH患者67例作為實驗組。其中男性46例，女性21例；年齡19～65歲，平均（43.75±11.35）歲。納入標準：①符合2016年中華醫學會骨科學分會關節外科學組制定的《股骨頭壞死臨床診療規范》的診斷標準[7]；②符合國際骨循環學會（association research circulation osseous, ARCO）的Ⅱ～Ⅳ期患者；③采血前未予任何干預措施。患者按病因分類：創傷性10例、酒精性24例、激素性23例、特發性10例；按ARCO分期分類：Ⅱ期13例、Ⅲ期27例、Ⅳ期27例。選取同期在本院體檢中心體檢正常且排除酗酒、近半年使用過影響骨代謝藥物或激素的健康群眾67例作為對照組。其中男性40例，女性27例；年齡19～65歲，平均（42.64±10.46）歲。兩組患者性別比例、平均年齡比較，差異無統計學意義（χ2/t=1.169和0.589，P=0.368和0.557）。患者既往無冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病、高血壓及乙肝等慢性病史。本研究符合赫爾辛基宣言，患者在納入研究前均簽署知情同意書并經醫院倫理委員會批準（編號：20140307）。本研究在中國臨床試驗注冊中心注冊（注冊號：ChiCTR-RPC-15006290）。所有原始數據來自廣州中醫藥大學第一附屬醫院關節骨科數據庫系統V1.0（登記號：2017SR274625）。

1.2 方法

1.2.1 血液標本采集 用真空采血管分別抽取兩組研究對象的空腹靜脈血約2 ml，置于4℃冰箱自然凝固后3 000 r/min離心5 min，提取血清，分裝后置于-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 DKK1蛋白的檢測 采用酶聯免疫吸附法測定研究對象的血清DKK-1蛋白濃度，試劑盒購自美國的R＆D公司。檢測嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3 觀察指標

①兩組患者血清DKK-1蛋白濃度差異；②不同病因、ARCO分期之間的血清DKK-1蛋白濃度差異；③實驗組血清DKK-1蛋白濃度與ARCO分期的相關性分析；④血清DKK-1蛋白診斷股骨頭壞死塌陷的特異性及敏感性。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 24.0統計學軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析，計數資料以構成比表示，比較用χ2檢驗。相關分析采用Spearman法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗組組內及與對照組組間血清DKK-1蛋白濃度比較

實驗組和對照組血清DKK-1蛋白濃度分別為（68.03±32.53）和（54.78±30.46）pg/ml，經t檢驗，差異有統計學意義（t=2.433，P=0.016），實驗組血清DKK-1蛋白濃度高于對照組。實驗組塌陷前與塌陷后的ONFH患者血清DKK-1蛋白濃度分別為（45.68±17.50）和（73.41±33.11）pg/ml，經t檢驗，差異有統計學意義（t=-4.186，P=0.000）。實驗組創傷性、酒精性、激素性和特發性ONFH患者血清DKK-1蛋白濃度分別為（58.18±39.67）、（72.53±29.37）、（64.60±26.20）和（74.96±45.34）pg/ml，經單因素方差分析，差異無統計學意義（F=0.685，P=0.565）。實驗組ARCO Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期ONFH患者血清DKK-1蛋白濃度分別為（45.68±17.50）、（71.56±32.16）和（75.26±34.54）pg/ml，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=4.280，P=0.018），其中Ⅱ期與Ⅲ期患者血清DKK-1蛋白濃度比較，差異有統計學意義（F=7.523，P=0.016），Ⅱ期與Ⅳ期患者血清DKK-1蛋白濃度比較，差異有統計學意義（F=4.823，P=0.006），Ⅲ期與Ⅳ期患者血清DKK-1蛋白濃度比較，差異無統計學意義（F=0.000，P=0.662）。

2.2 ONFH患者血清DKK-1蛋白濃度與ARCO分期的相關性

血清DKK-1蛋白濃度與ARCO分期呈正相關（r=0.281，P=0.021）。見圖 1。

2.3 血清DKK-1蛋白診斷ONFH塌陷的敏感性及特異性

采用ROC曲線分析ONFH患者塌陷前及塌陷后血清DKK-1蛋白濃度，結果顯示:曲線下面積為0.754，敏感性為 57.40%（31/54）（95%CI：0.633，0.851）；特異性為 100.00%（0/13），cut-off值為＞71.71 pg/ml。見圖2。

圖1 血清DKK-1蛋白濃度與ONFH ARCO分期的相關性

圖2 血清DKK-1蛋白診斷ONFH塌陷的ROC曲線

3 討論

ONFH是導致青壯年髖關節功能障礙的常見疾病之一[8]。在未進行有效治療的情況下，80%的ONFH患者在1～3年內會發展為股骨頭塌陷，大多數患者晚期會發展為嚴重的髖關節骨關節炎，不可避免的要行人工髖關節置換術[9]。在中國，初次行人工髖關節置換術的費用是8 000～10 000美元，對患者造成巨大的經濟負擔[10]。因此，早期發現及診斷ONFH，保留患者自身髖關節，對患者及社會都大有益處。而預防和糾正塌陷直接關系到保髖治療的效果[11]。

近年發現Wnt信號通路與骨重塑密切相關，其中研究最多的是經典Wnt/β-catenin信號通路[12]。Wnt蛋白與卷曲蛋白在細胞外與受體LRP5/6結合形成復合物，啟動和激活Wnt/β-catenin信號通路。此通路一方面可促進成骨細胞增殖和分化，主導骨骼的發育和修復，另一方面可抑制破骨細胞分化，減少骨吸收[12-13]。

在骨骼系統中，DKK-1由成熟的成骨細胞和骨細胞分泌產生，是骨代謝和關節重塑的調節因子[14]。DKK-1可通過與受體LRP5/6結合而阻斷Wnt/β-catenin信號通路，減少成骨細胞增殖并增加其凋亡，同時可誘導破骨細胞分化和成熟、促進骨吸收，進而破壞骨穩態，引起一系列骨病[5]。MANARA等[15]研究發現DKK-1表達增加，可促進成骨細胞凋亡，減少骨形成，影響骨重塑。DKK-1蛋白是成骨細胞的有效負調節因子[16]。

目前，越來越多的研究發現，ONFH與骨細胞、成骨細胞凋亡和骨重塑失衡密切相關[3，17]。因此理論上血清DKK-1蛋白濃度會隨著ONFH患者病情發展而升高。本實驗結果表明，實驗組血清DKK-1蛋白濃度與對照組比較，在ONFH患者中升高，塌陷后較塌陷前升高，且與ARCO分期呈正相關，由ROC曲線可知，血清DKK-1蛋白在診斷股骨頭壞死塌陷時具有一定的敏感性和特異性。從ROC曲線計算的cutoff值有助于確定塌陷的臨界值，此臨界值可能為塌陷的征兆。因此，檢測血清DKK-1蛋白濃度有助于監測ONFH患者病情進展，cut-off值可作為臨床預測股骨頭塌陷的參考指標。

本實驗結果也表明，不同病因的患者血清DKK-1蛋白濃度比較無差異，這可能是由于各種病因的ONFH均可造成骨重塑失衡、骨細胞凋亡。有學者通過動物實驗研究發現激素性壞死的小鼠股骨頭內，成骨細胞數量和骨量明顯低于對照組，且伴有DKK-1表達增加[16-17]。魏秋實等[18]研究發現，激素性與酒精性ONFH標本內空骨陷窩率明顯增高，存在骨細胞凋亡。MUTIJIMA等[19]研究發現不同病因的ONFH標本內成骨細胞和骨細胞凋亡顯著高于非ONFH。上述學者的研究表明不同病因的ONFH均存在骨細胞凋亡，所以理論上不同病因的ONFH患者血清DKK-1蛋白濃度均會升高。

綜上所述，血清DKK-1蛋白濃度與股骨頭壞死患者病情發展密切相關，在臨床上，可作為ONFH早期診斷及治療的參考指標之一，也可為今后ONFH的病情監測及預防塌陷提供一定的理論依據。但目前對于DKK-1參與ONFH的具體過程仍未完全了解，還需進一步的實驗研究，其臨床價值同樣也需要更有力的臨床研究來證實。