淺析吉西他濱對人非小細胞肺癌A549細胞增殖與凋亡的影響

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(肇慶醫(yī)學高等專科學校基礎醫(yī)學部，廣東 肇慶 526020)

肺癌為全球最為常見的一種惡性腫瘤，具有較高發(fā)病率與死亡率，其發(fā)病病因主要與吸煙、遺傳、職業(yè)暴露、環(huán)境污染、電離輻射等因素相關。患者發(fā)病后會出現胸部脹痛、咯痰、痰血、低熱等癥狀。有相關研究表示，在肺癌總數中，非小細胞肺癌達到80%左右[1-2]。肺小細胞肺癌主要有腺癌、鱗癌、大細胞癌等，與小細胞肺癌相比，其具有癌細胞生長分裂較慢的特點，癌細胞擴散與轉移也較晚[3]。非小細胞肺癌患者常見并發(fā)癥包括胸腔積液、淋巴轉移、心包積液等，目前臨床治療非小細胞肺癌主要采用分期手術、化療等手段。雖然目前醫(yī)學相對較為發(fā)達，醫(yī)學技術不斷進步與發(fā)展，但非小細胞肺癌預后相對較差，患者生存率降低。有相關研究表示，細胞增殖與及凋亡與腫瘤發(fā)生具有密切的關系，人體內正常細胞凋亡功能減弱，使得異常細胞難以被清除，導致基因調控難以維持平衡，進而堆積形成腫瘤[4-5]。因此臨床將誘導腫瘤細胞增殖和凋亡作為目前治療非小細胞肺癌的主要原則。吉西他濱是一種新型抗代謝腫瘤藥物，本研究通過分析吉西他濱體外對人非小細胞肺癌A549細胞增殖及凋亡的作用，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：資料收集時間在2014年2月～2016年5月，對象為人非小細胞肺癌A549細胞，由我院呼吸內科實驗室進行冰凍儲存。細胞培養(yǎng)：使用RPMI1640 培養(yǎng)液在5%二氧化碳、37℃的細胞培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)，采用0.02%乙二胺四乙酸與0.25%胰酶進行消化傳代，使用比例為1∶1，本次研究所用細胞均處于指數生長期。

1.2方法：MTT法：使用0.25%胰蛋白酶對細胞進行消化，接種96孔板，密度為1×104，將無細胞的培養(yǎng)液作為空白對照。細胞貼壁后將不同濃度吉西他濱加入，隨后采用酶聯免疫儀對490 nm處的吸光度值進行檢測。

流式細胞儀：不同濃度藥物對細胞處理72 h后行細胞消化，并將懸浮細胞進行收集，將密度調整為5×105～1×106個/ml，將1 ml細胞離心操作，加入70%乙醇于細胞內，并將置于-20℃低溫固定過夜，采用PBS進行清洗2次。隨后加入PI 50 μg/ml與Rnase A 1 mg/ml，于室溫避光條件下進行染色處理，半小時后上機進行檢測。

Annexin V-PI雙標法：將不同濃度藥物對細胞處理72 h后，經流式細胞儀檢測后使用CELIQUEST軟件對其凋亡率進行分析。bcl-2表達檢測：將細胞在不同吉西他濱濃度下分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，隨后將其制成蓋玻片，進行細胞標本培養(yǎng)，采用配套試劑盒操作后，使用圖像分析儀分析。

2 結果

2.1吉西他濱體外對A549細胞增殖影響：不同濃度吉西他濱對A549細胞均有抑制作用，在時間、劑量上差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1。

圖1 吉西他濱體外對A549細胞增殖的影響：縱軸代表抑制率(%)，橫軸代表藥物濃度(μg/ml)

2.2不同濃度吉西他濱體外對A549細胞周期影響：藥物濃度增加后，G0/G1使其細胞比例逐漸升高，S時期比例逐漸下降，提示藥物濃度對細胞周期有顯著影響。見表1。

濃度(μg/ml)G0/G1SG2/M0.00151.7±3.234.5±5.214.6±2.70.0142.5±3.738.7±4.317.9±2.30.141.3±5.149.5±6.111.1±3.7115.9±4.271.8±4.69.1±2.3

2.3細胞凋亡率分析：經Annexin V-PI雙標法檢測結果顯示，72 h后不同濃度細胞凋亡率分別為(4.8±0.3)%、(8.1±0.6)%、(14.9±0.4)%、(31.6±1.2)%，提示吉西他濱濃度增加，細胞凋亡率為顯著增加。

2.4bcl-2表達：經免疫組化法后，DAB染色后可見各組細胞漿內有棕黃色物質，呈顆粒狀，分布深淺不一，將藥物處理前后細胞棕黃色物質平均吸光度進行比較，配對t檢驗后差異有統計學意義(P<0.05)。提示經吉西他濱作用后，bcl-2表達與細胞凋亡率有相關性，呈負相關。

3 討論

細胞凋亡指在細胞調控下由基因介導發(fā)生的主動自殺現象[6]。細胞凋亡與調控基因出現異常可有效反映出人體內腫瘤的生物學特性。因此誘導腫瘤細胞增殖及凋亡成為近年來臨床工作者研究腫瘤的重點。吉西他濱是一種新型胞嘧啶核苷衍生物，進入人體后通過脫氧胞嘧啶激酶活化，通過胞嘧啶核苷脫氨酶代謝，是一種抗腫瘤藥物[7-8]。吉西他濱通過在細胞內轉化為磷酸化代謝物，有效發(fā)揮出細胞毒效果。有相關研究表示，吉西他濱藥敏性與人體內dCK水平有密切相關性，成正相關性。吉西他濱進入人體后，被體內細胞攝入，會轉化為活性代謝物，如二磷酸酯、三磷酸酯等，可競爭性對DNA鏈延長進行有效抑制，進而促使DNA片段形成與細胞發(fā)生死亡。

有相關研究結果表示，吉西他濱在非小細胞肺癌治療中具有一定效果。但目前臨床對吉西他濱抑制腫瘤的作用機制并不清楚，相關研究也較少。本次研究中分析了吉西他濱對A549細胞凋亡增殖、周期、凋亡的影響。結果顯示不同濃度吉西他濱對A549細胞均有抑制作用，在時間、劑量上均差異有統計學意義(P<0.05)。通過流式細胞儀檢測出細胞周期，藥理學特性主要作用S期。采用Annexin V-PI雙標法獲取不同藥物濃度下的凋亡率，隨藥物濃度增加，細胞凋亡率逐漸升高，提示吉西他濱誘導細胞凋亡效果顯著。

雖然吉西他濱誘導細胞凋亡效果顯著，可作為治療非小細胞肺癌的有效藥物，但大部分細胞對藥物存在一定抵抗性，目前臨床對吉西他濱如何誘導細胞凋亡的作用機制尚不完全明確。筆者認為，可通過選擇性激活通道增加藥物療效，有效降低其細胞耐藥性。有相關研究表示，吉西他濱可有效促進和核濃縮與凋亡通路效應Caspase-3激活，對特定蛋白底物水解進行有效抑制，并通過核轉錄因子與Akt有效使細胞凋亡[9-10]。另外有相關研究表示，吉西他濱誘導腫瘤細胞凋亡與神經酰胺途徑相關，可通過對神經鞘脂循環(huán)進行激活，進而生成內源性神經酰胺使其聚集，對Caspase-3進行激活，進而誘導Caspase-9與bcl-X發(fā)生剪接變化[11]。由神經酰胺介導的腫瘤細胞凋亡可使用Caspase抑制劑進行阻滯，也能被bcl-2進行抑制。但目前臨床對bcl-2介導有無參與到吉西他濱誘導細胞凋亡的過程中尚不清楚，相關研究較少。本次研究中，通過使用免疫組化染色處理后，將藥物作用前后吸光度值進行比較，發(fā)現bcl-2表達呈下調現象，其與細胞凋亡率間關系呈負相關。bcl-2表達下調可對Ca2+進行阻斷，保持滑面內質網鈣的穩(wěn)定性，進而阻止細胞凋亡出現，此外還可通過對Caspase-3激活進行抑制，將生理性刺激、病理性刺激誘導細胞凋亡的過程進行抑制。

綜上所述，吉西他濱用于非小細胞肺癌治療中具有一定效果，可有效對A549細胞體外增殖進行抑制，并誘導細胞凋亡，bcl-2參與細胞凋亡過程中并具有一定作用。但目前其在人體內具體機制尚不清楚，還需進行深入研究與分析。